显微切割技术2.ppt

在肿瘤分子病理学研究领域里，常常借助于分子生物学的技术进行DNA、RNA的分析，但因为瘤组织是一个异质性的细胞群，肿瘤组织中大量的非瘤成分成为对瘤细胞DNA、RNA进行非原位分析的主要障碍，而显微切割技术正可以解决这类问题。 应用举例 * * 显微切割技术 研究某疾病发病的分子机制时，常要研究某种特定细胞的基因变化或基因间的相互作用方式在发病中的作用，但人体组织是由多种不同类型或不同病变阶段的细胞组成（组织异质性），其中往往还混杂相当数量的炎症细胞，因此以整块组织为起始材料研究基因表达变化，所得结果并不能真实反映疾病分子水平的改变 选取的研究材料需要在某一方面具有相同的特征，即具有一定程度的同质性 随着研究的不断深入需要在组织细胞中分离的研究材料日趋微小(例如要收集分离组织内的单个细胞或细胞内的特殊组分如核仁或包含体或染色体的某一区带等) ，常规手段往往不易做到 一、显微切割技术概述 显微切割技术是在显微状态或显微镜直视下通过显微操作系统对欲选取的材料(组织、细胞群、细胞、细胞内组分或染色体区带等)进行切割分离并收集用于后续研究的技术。 （一）显微切割的特点 一、 细微 由于是在显微状态并采用特殊的分离收集手段，显微切割的对象可以达到微米级，显微切割的精度可以达到纳米级，因此利用显微切割技术可以分离收集到像核仁和包含体及染色体特异区带这样细微的对象； 二、原位 利用显微切割技术是在组织细胞或染色体的原位取材，因此所取材料的定位清楚 例如 霍奇金淋巴瘤中瘤组织成分多样，特征性的瘤细胞(R—S细胞及其变异型)占细胞成分的2％左右，且呈散在性分布，如果常规地用组织匀浆的方式从组织中提取蛋白质或核酸，则既包含了来自瘤细胞的成分，又包含了来自淋巴细胞、浆细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、组织细胞等多种非瘤细胞的成分，这样所提的蛋白质或核酸来自何种细胞并不清楚，而如果用显微切割技术则可以选择我们需要的细胞，以使研究对象的背景明确； 三、同质 显微切割技术可以保证所取材料一定层次上的同质性 四 、结合 显微切割技术在微观领域对研究材料分离收集，可以与多种分子生物学、免疫学及病理学技术结合使用 由于显微切割技术具有上述特点，故其在分子病理学研究中的应用十分广泛 （二）显微切割的方式 手动直接显微切割 机械辅助显微切割 液压控制显微切割 激光捕获显微切割 (laser capture microdissection)。 手动直接显微切割是早期的切割方式．它是直接在显微镜下手持切割用针分离组织或细胞群，此种方式切割精度低，只适用于对较大块组织中的局部区域或细胞群进行分离，切割单个细胞十分困难； 机械辅助显微切割是利用普通光学显微镜的微调旋钮控制切割针切割细胞， 此方式切割精度较手动直接显微切割的精度有了提高．可以达到对较大的单个细胞的切割，而且此方式简单易行低耗，尤其适合于基层和无专用设备的单位，但由子显微镜的微调旋钮只能进行二维控制，对切割后的细胞进行收集较为困难，且切割精度仍然较低； 液压控制显微切割是采用液压式显微操纵系统配合倒置显微镜进行显微切割，它通过液压系统可提供X轴、Y轴和Z轴三个方向的精确的三维控制．其切割精度是目前各种方式中最高的、也是很多实验室常用的方法，其不足是不能实现显微切割的自动化，要收集较大量的目的组分时耗时长，效率低； 激光捕获显微切割是目前最为先进的方式，它快速方便，可从大量的研究材料中迅速捕获较多的目的组分，自动化程度高，但这需要昂贵的专用设备。 激光显微切割系统 （三）显微切割的材料 为各种方式贴附于固相支持物上的各种组织细胞成分，石蜡组织切片、冰冻组织切片、细胞铺片、细胞爬片、细胞甩片、培养细胞、常规制备的染色体等均可采用。 根据研究目的 不同选择不同材料 ， 进行RNA分析 通常采用冰冻组织切片或新制备的细胞片；在回顾性研究中福尔马林固定石蜡包埋的组织切片应用最为广泛。 （四）显微切割的结合技术 1. 如何识别欲切割的细胞 根据研究的需要可在显微切割前应用组织化学、免疫组织化学、原位杂交、原位末端标记、原位PCR、FISH、组织特染等方法对需要切割的组织内成分进行标记。 2. 如何对巳切割的细胞进行分析 显微切割后获得的材料可以用于提取蛋白质、DNA和RNA等用于Western Blot、Northern Blo