基因扩增检验标本的处理保存及核酸提取方法方案说明.ppt

核酸的提取 核酸包括DNA、RNA两种分子，在细胞中都是以与蛋白质结合的状态存在，核酸提取的主要步骤为： 裂解细胞 去除与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子，去除其他不需要的核酸分子，如提取DNA分子时，应去除RNA，反之亦然。 沉淀核酸 纯化核酸，去除盐类，有机剂等杂质 (一)DNA提取的经典方法 DNA提取的经典方法，即所谓的酚-氯仿提取法。因为使用两种不同的有机溶剂交替抽提更容易将蛋白除去，提取次序为酚、酚/氯仿（1：1）、氯仿，这种方法提取的DNA纯度高、片段大、效果好，缺点是较为繁琐。 经前处理的标本加入蛋白酶K,摇匀 56oC温育1小时,或37 oC消化6小时以上/过夜 加入等体积饱和酚,充分混匀  12000rpm,离心5分钟 将上层水相移至一干净离心管内，加等体积酚/氯仿(1:1)混合液，混匀 12 000rpm，离心5分钟 取水相，移至一干净离心管内，加等体积氯仿，混匀后12000rpm，离心5分钟 取水相，移至一干净离心管内，加2倍体积预冷的无水乙醇，沉淀DNA 摇匀，可见白色絮状DNA，置-20oC，30分钟或过夜 12000rpm，离心5分钟 弃上清，用预冷70%乙醇洗两次，室温干燥5分钟 加适量TE缓冲液或无菌去离子H2O溶解DNA，混匀 紫外分光光度仪测OD值，4oC备用 说明： 回收上层水相时，一定不要接触两相的界面，以免将蛋白质等物质吸入新离心管。 沉淀DNA，无水乙醇是首选的有机溶剂。另：异丙醇、醋酸钠等。 70%乙醇漂洗DNA，是为了去除残余的盐类，去除过量SDS和酚等杂物，因为SDS在70%的乙醇中保持溶解状态，不与DNA共沉淀，从而通过弃上清液去除这种去污剂,避免对以后PCR反应的影响。 TE缓冲液：10mmol/L Tris-Hcl 1mmol/L EDTA pH 8.5或 8 RNA的提取 RNA提取条件较DNA要求严格，主要是因为临床标本及实验室环境中，存在大量对RNA有强烈降解作用RNase。RNase是一类生物活性非常稳定的酶类。这种酶耐酸、耐碱、耐高温，如煮沸也不能使之完全失活。 蛋白质变性剂可使之暂时失活，但变性剂去除后，又可恢复活性。除细胞内RNase以外，环境中灰尘、各种实验器皿和试剂、人体的汗液及唾液中均存在RNase，因此在提取RNA时，关键要避免RNase对标本的污染及防止RNase对提取的RNA的降解。 基因扩增检验标本的处理保存及核酸提取方法 江西省临床检验中心 应用聚合酶链反应（PCR）技术测定临床标本中的病原体核酸成分，是一种高度敏感，且最为直接的检测手段。由于临床标本中含有蛋白质、脂类等物质，可干扰PCR反应，故在做PCR反应前必须进行核酸提取。 经典的核酸提取方法通常是加去污剂（SDS等）裂解细胞，经蛋白酶处理、有机溶剂提取及乙醇沉淀等步骤。 由于样本的处理及保存对DNA和RNA（尤其是RNA）的影响较大，因此在核酸测定时标本的处理及适当保存对测定结果的准确有效非常重要。 HBV：标本通常由医护人员采集，应注意避免溶血，如为血浆标本注意抗凝剂的选 择，一般用EDTA-Na2或枸橼酸纳，不可使用肝素。标本为全血时，及时分离出血浆，提取病毒DNA进行检测。 HCV：检测RNA病毒。由于RNA极易降解，标本的制备和保存方式往往可以影响测定结果。若用血浆标本，应使用EDTA抗凝。严禁使用肝素，因其对PCR扩增有抑制作用, 且无法在核酸提取过程中去除。抗凝后6小时内分离血浆。如用血清标本，则应尽快（2小时内）分离血清 进行检测，或-20oC保存。 全血标本 通常用来提取外周血单个核细胞核酸：如基因组DNA、线粒体DNA、总RNA等。 抗凝剂：一般使用EDTA-Na2、枸橼酸纳，不使用肝素。 前处理： 1）加适量的红细胞裂解液（破膜液），裂解全血中的红细胞。 2）再加适量的细胞核裂液（破核液），裂解白细胞中的细胞核，使核内DNA 释放出来。 3）然后再加SDS（十二烷基硫酸钠）等去污剂，溶解脂蛋白，解聚核蛋白。 SDS可与蛋白 质结成复合物，使蛋白质变性沉淀，但SDS在以后的核酸提取过 程中必须除去。 痰标本 痰属于分泌物，临床上常用作结核杆菌DNA测定样本，由于痰标本中含大量粘蛋白和杂质，故在核酸提取时，一定要对标本进行前处理，即用4%NaOH液化，去除粘蛋白，然后用煮沸或蛋白酶、酚/氯仿等经典法提取DNA。 具体方法： 用无菌平皿取患者肺深部咳出的痰液1-3ml， 加入4倍体积4%NaOH，摇匀，室温下放置30分钟左右液化 取1.5ml EP管，加0.5ml 液化痰液，再加0.5ml 4%NaOH室温放10分钟