大豆贮藏蛋白基因启动子的克隆与功能分析.pdfVIP

大豆贮藏蛋白基因启动予白锣礁与功能分析 摘要 目前，基因工程中存在的主要问题之一是外源基因的表达水平、表达部位等问题， 因此，作为调控基因表达关键元件之一的启动子的研究便成为基因工程研究的关键。根 据启动子的转录模式可将其分为三类：组成型启动子(constitutivepromoter)、组织特异性 物表达载体中应用最广泛的是CaMV 35S组成型启动子，它导致外源基因在转基因植物 的所有部位和所有发育阶段都表达，不但造成能源的浪费还会引起植物的形态发生改 变，影响植物的生长发育。这就使人们越发注重特异表达启动子的研究和应用，特异性 启动子指导外源基因定向地在人们预定的时间和空间(组织或器官)表达，不仅能使目的 基因的表达产物在～定空间积累，增加区域表达量，并且使外源基因的表达处于人们的 控制之下，既保证了外源基因在植物体内的有效发挥又减少了对植物的不良影响。利用 具有特异性表达特性的启动子被认为是实现对目标基因高表达的重要途径，也是培育高 效、安全转基因作物的首选。 11S球蛋白是大豆种子中主要的贮藏蛋白，由多基因家族编码，迄今为止已有七个 大豆球蛋白基因被克隆、测序，分别是C,yl至C,y7。大豆种子贮藏蛋白具有种子特异性 时序表达的功能，在种子成熟的中后期瞬时性的大量合成并贮存于种子蛋白体中。这种 种子特异性时序表达的功能主要取决于种子贮藏蛋白基因上游调控序列，所以贮藏蛋白 基因启动子成为了研究高等植物基因特异性表达调控的首选材料。我们以大豆品种“吉 到pMDl8．TVector上，经大肠杆菌转化后进行蓝自斑筛选，挑取白斑碱裂解法提取质 粒，进行PCR检测和限制性内切酶酶切鉴定，鉴定后的菌株送交大连宝生物公司测序， 并进行BLAsT分析。测序结果表明所克隆的片段长为963bp，与预期设计的大小一致， 该片段与已发表的llS球蛋白基因启动子序列的相似性为45．2％，但所含的启动子序列 元件的数量和距离上很相似，均具有有典型的TATA盒和CAAT盒，以及种子特异表达 所必须的调控元件。 接，获得了由该启动子驱动GUS报告基因的新型植物表达载体pGy．G嬲。通过液氮冻 化烟草品种NC89。在含有Kan和Cef抗生素的MS选择培养基上进行筛选培养，结果 获得6株转pC,y．GUS基因植株。对6株转基因苗进行PCR检测，以未转基因的植株作 为阴性对照，结果6株再生苗扩增出与目的片段大小一致的条带。对PCR检测呈阳性 的转基因植株进行Southern杂交检测，杂交结果显示有4株有明显杂交信号，说明目的 基因已成功整合到烟草基因组中。 为了验证所扩增的启动子是否具有种子特异性表达的功能，我们对转pGy．GUS、 质粒烟草的根、茎、叶未显色，而种子显蓝色，表现出明显的种子特异性：而转pBIl21 质粒烟草的根、茎、叶、种子均显蓝色，由此初步得出结论：由该启动子序列引导的 GUS基因能在种子中表达，而在其它组织中未表达，证实该启动子具有种子特异性表达 的功能。本论文的完成为贮藏蛋白基因表达调控机制的研究提供理论依据，还可以在植 物的特定部位或发育阶段生产有用蛋白质或其他代谢产物，以实现对外源基因表达的定 时、定点、定量三维精确调控。 关键词：贮藏蛋白，启动子，转基因烟草，种子特异表达，GUS基因 JI andFunctionalofthePromoferof Protein Cloning Analysis Storage Genein Soybean Abstract themain as existedin arearound suchthe Nowadaysproblems engineeringproblems gene