反胶束萃取方法步骤.pptVIP

反胶束萃取 随着基因工程和细胞工程的发展，尽管传统的分离方法（如溶剂萃取技术）已在抗生素等物质的生产中广泛应用，并显示出优良的分离性能，但它却难以应用于蛋白质的提取和分离。其主要原因有两个：一是被分离对象—蛋白质等在40~50℃便不稳定，开始变性，而且绝大多数蛋白质都不溶于有机溶剂，若使蛋白质与有机溶剂接触，也会引起蛋白质有变性；二是萃取剂问题，蛋白质分子表面带有许多电荷，普通手离子缔合型萃取剂很难奏效。因此研究和开发易于工业化的、高效的系列化物质分离方法已民为当务之急。反胶束萃取法就是在这一背景下发型起来的一种新型分离技术。 1977年，瑞士的Luisi等人首次提出用反胶束萃取蛋白质，但并未引起人们的广泛注意。直到80年代，生物学家们才开始认识到其重要性，荷兰的Van’t Riet和Dekker、美国的Gokelen和Hatton首先进行了反胶束萃取蛋白质的研究。近年来该项研究已在国内外深入展开，从所得结果来看，反胶束萃取具有成本低、溶剂可反复使用、萃取率和反萃取率都很高等突出的优点。此外，反胶束萃取还有可能解决外源蛋白的降解，即蛋白质（胞内酶）在非细胞环境中迅速失活的问题，而且由于构成反胶束的表面活性剂往往具有溶解细胞的能力，因此可用于直接从整细胞中提取蛋白质和酶。可见，反胶束萃取技术为蛋白质的分离提取开辟了一条具有工业开发前景的新途径。 9.1 反胶束溶液形成的条件和特性 反胶束溶液是透明的、热力学稳定的系统。反胶束（reversed micelle）是表面活性剂分散于连续有机相中一种自发形成的纳米尺度的聚集体，所以表面活性剂是反胶束溶液形成的关键，应该首先介绍。 9.1.1 表面活性剂 表面活性剂是由亲水憎油的极性基团和亲油憎水的非极性基团两部分组成的两性分子，可分为阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂和非离子表面活性剂，它们都可用于形成反胶束。常用的表面活性剂及相应的有机溶剂见表10.1。 在反胶束萃取蛋白质的研究中，用得最多的是阴离子表面活性剂AOT（AerosolOT），其化学名为丁二酸-2-乙基已基酯磺酸钠，结构式见图10.1。 这种表面活性剂容易获得，其特点是具有双链，极性基团较小，形成反胶束时不需加助表面活性剂，并且所形成的反胶束较大，半径为170nm，有利于大分子蛋白质进入。 常使用的阳离子表面活性剂名称和结构如下： CTAB （cetyl-trimethyl-ammonium bromide） 溴化十六烃基三甲胺 DDAB（didodecyldimethyl ammonium bromide） 溴化十二烷基二甲铵 TOMAC（trioctylmethyl ammonium chloride） 氯化三辛基甲铵 将阳离子表面活性剂如CTAB溶于有机溶剂形成反胶束时，还需加入一定量的助溶剂（助表面活性剂）。 反胶束的必要几何条件是堆砌率 (V/L)/a01 （V为碳氢链平均体积，L为碳氢链的长度，a0为在表面活性剂极性头面积）。 9.1.2 临界胶束浓度（Critical Micelle Concentration） 临界胶束浓度，是胶束形成所需表面活性剂的最低浓度，用CMC来表示，这是体系特性，与表面活性剂的化学结构、溶剂、温度和压力等因素有关。CMC的数值可通过测定各种物理性质的突变（如表面张力、渗透压等）来确定，见图10.2。 从图9.2中可以看出表面活性剂十二烷基硫酸钠与溶液物理化学性质之间的关系，在浓度为0.008mol/L时各性质都有一个突变现象。 由于实验方法不同，所得的CMC值往往给于完全一致，但是突变点总是落在一个很窄的浓度范围内，故用CMC范围来表示更为方便。 表9.2是几种类型表面活性剂的CMC值，可以看出，CMC值与活性剂的结构有一定的联系。在非极性溶剂中CMC值的变化范围是 1.0×10-4~1.0×10-3mol/L。 9.1.3 胶束与反胶束的形成 正常胶束（，结构示意图见图10.3（a）。 在胶束中，表面活性剂的排列方面是极性基团在外，与水接触，非极性基团在内，形成一个非极性的核心，在此核心可以溶解非极性物质。 反胶束，其结构示意图见图10.3（b）。 在反胶中，表面活性剂的非极性基团在外与非极性的有机溶剂接触，而极性基协和则排列在内形成一个极性核（polar core）。此极性核具有溶解极性物质的能力，极性核溶解水后，就形成了“水池”（water pool）。 当含有此种反胶束的有机溶剂与蛋白质的水溶液接触后，蛋白质及其他亲水物质能够通过螯合作用进入此“水池”，由于周围水层和极性基团的保护，保持了蛋白质的天然构型，不会造成失活。蛋白质的溶解过程和溶解后的情况示意于