质粒DNA的碱裂解法提取与纯化细菌质粒是一类双链闭环的DNA.PDFVIP

中国试剂网 3.9.265 质粒DNA 的碱裂解法提取与纯化 细菌质粒是一类双链、闭环的DNA ，大小范围从1kb 至200kb 以上不等。各种 质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常 情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合 到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。 质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯 化的质粒DNA 分子。目前已有许多方法可用于质粒DNA 的提取，本实验采用 碱裂解法提取质粒DNA 。 碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA 的方法，其基本原理为：当菌 体在NaOH 和SDS 溶液中裂解时，蛋白质与DNA 发生变性，当加入中和液后， 质粒DNA 分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色 体DNA 不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。 纯化质粒DNA 的方法通常是利用了质粒DNA 相对较小及共价闭环两个性质。 例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二 醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。对于小量制备的质粒DNA ， 经过苯酚、氯仿抽提，RNA 酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和 RNA ，所得纯化的质粒DNA 已可满足细菌转化、DNA 片段的分离和酶切、常 规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。 一、试剂准备 1. 溶液Ⅰ: 50mM 葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0) ，10mM EDTA(pH 8.0）。1M Tris-HCl(pH 8.0 ）12.5ml，0.5M EDTA （pH 8.0 ）10ml，葡萄糖4.730g ，加ddH2O 至500ml 。在10 lbf/in2 高压灭菌15min ，贮存于4 ℃。 2. 溶液Ⅱ：0.2N NaOH，1% SDS。2N NaOH 1ml ，10%SDS 1ml，加ddH2O 至 10ml。使用前临时配置。 3. 溶液Ⅲ：醋酸钾 （KAc ）缓冲液，pH 4. 。5M KAc 300ml，冰醋酸 57.5ml ， 加ddH2O 至500ml 。4 ℃保存备用。 4. TE ：10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)。1M Tris-HCl （pH 8.0 ）1ml， 0.5M EDTA （pH 8.0 ）0.2ml，加ddH2O 至100ml。15 lbf/in2 高压湿热灭菌20min ， 4 ℃保存备用。 中国试剂网 3.9.265 5.苯酚/氯仿/异戊醇 （25 ：24 ：1） 6.乙醇 （无水乙醇、70%乙醇） 7. 5 ×TBE ：Tris 碱54g，硼酸27.5g，EDTA-Na2 ·2H2O 4.65g，加ddH2O 至 1000ml。15 lbf/in2 高压湿热灭菌20min ，4 ℃保存备用。 ．溴化乙锭 （EB ）：10mg/ml 9.RNase A （RNA 酶A ）：不含DNA 酶(DNase-free) RNase A 的10mg/ml，TE 配 制，沸水加热15min，分装后贮存于-20℃。 10. 6×loading buffer（上样缓冲液）：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF ，40%（W/V ） 蔗糖水溶液。 11. 1% 琼脂糖凝胶：称取1g 琼脂糖于三角烧瓶中，加100ml 0.5×TBE，微波炉 加热至完全溶化，冷却至60℃左右，加EB 母液 （10mg/ml）至终浓度0.5 μg/ml （注意：EB 为强诱变剂，操作时带手套），轻轻摇匀。缓缓倒入架有