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基因工程genetic engineering;什么是基因工程 基因工程基本原理和应用;基因工程的简史： ??1. 基因工程诞生的理论基础 基因工程的诞生依赖于在此之前生命科学基础理论的发展成就，概括起来主要包括三个方面： ⑴ 40年代确定了遗传物质是DNA，它是遗传信息的载体。 ⑵ 50年代发现DNA分子的双螺旋结构并揭示了半保留复制的机理，揭示了基因的自我复制和表达的机理。 ⑶ 50年代末至60年代初，相继提出了“中心法则”和操纵子学说，并成功破译了遗传密码，从而阐明了遗传信息的流向和表达问题。;2．工具酶的发现为基因工程的诞生奠定了技术的基础： 微生物中的限制现象。 从60年代起，发现并提取出了大量的工具酶（限制性内切酶、连接酶等），这为基因工程技术的形成打下了良好的基础。; 3．基因工程的诞生 1972年H.Boyer 和 P.Berg 第一次完成了DNA的体外重组实验，用E.coRI在体外对SV40的DNA和λ噬菌体的DNA进行了消化，然后用T4连接酶将消化后的DNA片段进行了连接，结果获得了重组的杂种DNA分子。;SV40;1973年S.Cohen 也成功的进行了另一个体外重组实验，他将编码有卡那霉素抗性基因的大肠杆菌R6-5质粒DNA与编码有四环素抗性基因的另一种大肠杆菌质粒pSC101 DNA混合后加入内切酶EcoRI对DNA进行切割，再用T4连接酶将它们连接成重组分子，用这种连接后的重组DNA转化大肠杆菌，结果发现，某些转化菌落表现出了既抗卡那霉素又抗四环素的双重抗性特征。 ; 基因工程的基本内容： 1．将两种不同来源的DNA－－即目的DNA和载体DNA提取纯化。 2．用限制性内切酶处理DNA。 3．用连接酶将切开的不同源的DNA连接到一起，构成重组DNA。 4．将重组DNA转化到大肠杆菌中。 5．通过大量的培养细菌，以达到扩增目的基因或表达蛋白的目的。;;l 基因工程的目的： 进行分子克隆 表达重组基因所编码的蛋白质 ;工具酶 一、?限制酶(restriction enzyme) l?? 全称限制性核酸内切酶、简称限制酶或内切酶。 ;1． 限制酶的分类 限制酶有三种：I型、II型、III型。;2. 限制酶的命名 一般的限制酶通常由四个拉丁文字母组成 第1个字母代表产生该酶的细菌的属名， 第2、3个字母代表产生该酶的细菌种名 第4个字母代表产生该酶的菌株号。;3. 限制酶的识别和切割位点 根据Ⅱ型酶种类割双链DNA产生3种不同的切口： ⑴产生平末端 ⑵产生5’端突出的粘性末端 ⑶产生3’端突出的粘性末端;;6. 限制酶使用的条件 ⑴　缓冲系统： 50mmol/L tris.Cl 10mmol/L Mg++ 1mmol/L DTT NaCl ⑵ 反应体积 ⑶ 反应温度和时间 ⑷ 限制酶的商业化;7. 限制酶的商业化 试剂公司的名称： Promaga公司 安玛西亚公司 大连保生物公司 　　北京赛百胜公司 北京华美公司 购买酶时的注意事项： 价格因素 供货时间 运输方式 酶的保存： ;修饰酶 ⒈逆转录酶 逆转录酶的用途 逆转录酶的种类： 禽类成骨细胞性白血病病毒(AMV)逆转录酶 小鼠白血病病毒(MMLV)逆转录酶 ⒉ T4DNA连接酶 从噬菌体中提取，用于DNA的连接;T4连接酶的连接;⒊ 碱性磷酸酶 可将DNA或RNA5’的磷酸去除，可用于制止不希望发生的连接反应进行。 ⒋末端脱氧核苷酰转移酶 用于将已标记好的单核苷酸加到DAN的3’端上，起到标记的作用；有时也可用于DNA片段的同聚尾的形成。 ;载 体(vector) 载体在基因工程中的作用: 将外源DNA插入其中，并一同转化或转染到宿主细胞中，能够稳定的保存下来，完成外源DNA克隆和表达的功能。 ;载体所必需的条件 1必须有自身的复制子，并能携带重组DNA一起复制。 2载体分子上必须有限制性内切酶位点即多克隆位点。 3载体必须具有可供选择的标置，便于重组分子的筛选。 4载体分子尽量小，便于能插入较大的外源DNA，最好是高考贝。 5表达载体必须具备能在宿主细胞中表达的能力。;?????一、常用的克隆载体 ?㈠质粒