WAF1蛋白质稳定性.docVIP

WAF1蛋白质稳定性 N.terminalFlagTag StabilizesP21cIp1FProtein LUFeng-min,LIYa-juan,ZHUANGHui rDepartmentofMicrobiology,PekingUniversity HealthScienceCenter,Being100083,China) O■变■童寞变■■■ N一端加flag标签 增加P21cipAF 蛋白质稳定性 鲁凤民/李雅娟/庄辉 (北京大学医学部病原生物学系,北京100083) 【摘要】背景与目的:已知细胞分裂周期抑制因子P21通过蛋白酶体通路降解,其氨基端的泛素化可能参与了这一过程.Flag为一 蛋白标签,常用于标记重组蛋白质,以便对靶蛋白进行生物学功能分析.本文旨在研究N_端加flag对P21蛋白质稳定性的影响.材料 与方法:建立稳定表达外源flag-p21蛋白质的NIH3T3细胞株,应用蛋白印迹法(WB)检测NIH3T3细胞表达的flag-p21,并比较其与内 源P21蛋白质半衰期的差异;确定阻断蛋白酶体水解通路对其降解过程的影响.结果:NIH3T3细胞表达的内源P21蛋白质半衰期约 30min,而同一细胞表达的flag-p21融合蛋白半衰期则明显延长;用抑制剂MC,-132阻断蛋白酶体水解通路后,121蛋白质的量明显增 加,但同一细胞内表达的flag-p21量却无明显改变.结论:N-端加flag标签可增加P21蛋白质的稳定性.在对P21蛋白质的生物学功 能进行研究时,应考虑N_端加flag对P21泛素化一蛋白酶体依赖的降解过程的影响. 【关键词】P21帅;nag标签;蛋白酶体;降解 中图分类号:R73文献标识码:A文章编号:1004—616X(2006)02—0119—03 [ABSTRACT]BACKGROUNDamp;A蹦:N-terminalubiquitinationmayplayaroleinp21WAFIdegradationvia proteasome-dependentproteolyticpathway.WestudiedtheinfluenceofaddingaN-terminalflagtagonthestabilityofp21 protein.MATERIALANDMETHODS:NIH3T3cellstablyexpressingflag-p21wassetupbyretroviruspWB3flag-p21infection followedbyBlasticidinselection.Half-lifeofp21proteinwastestedbywesternblotwithrabbitpolyclonalanti-p21antibody, andproteasomeinhibitorMG-132Wasemployedtotesttheroleofproteasomepathwayonthedegradationofp21protein. RESULTS:Half-lifeofendogenousp21inNIH3T3cellsWasabout30minutes,whilethehalf-lifeofexogenousflag-p21fusion proteinexpressedinthesalTletestedcellswasobviouslyincreased.AlthoughMG-132significantlyincreasedtheamountof endogenousp21protein,thereWasnodetectablechangeofflag-p21expressionundertheSaBlecondition.CONCLUSION: N-terminalubiquitinationgvasnecessaryforeffectivep21proteasome-dependentdegradation.Thataddingflagtagattheamino acidterminimaystabilizep21proteinshouldbeconsidered. f腰ywotmslP21cipt;flagtag;proteasome;degradation P21ip(简称P21)最早是通过免疫共沉淀发现 的,可与CDK2结合并抑制CDK2激酶的蛋白质(CDK inhibitedprotein,Cip1)….P21还是野生型P53的下游 作用因子(wild-typeP53activefactor,wAF1)….已知 的P21蛋白质的功能包括调控细胞分化,衰老和抑制 收稿日期:2005—10—12;修订日期:2005—12一O1 作者简介:鲁凤民(1963一),男