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tRNA^val-CTE复合核酶真核表达载体构建 第14卷第5期 2006年lO月 中国医学工程ChinaMedicalEngineeringVo1.14No.5 Oct.20o6 文章编号:1672—2019(2006)05—0449—03 tRNA-CTE复合核酶真核表达载体构建木 蒋永芳,龚国忠,许允,何艳,刘波 (中南大学湘雅二医院肝病研究中心,湖南长沙410011) ? 论着? 摘要:目的构建tP,_NA~-CTE复合核酶真核表达载体,为进一步研究打下基础.方法用RT—PCR法 扩增CTEcDNA;合成含tR_NA,~启动子和HCV5-NCR区195位的核酶以覆内切酶KpnI和EcoRV序 列,通过退火连接到pPUR质粒的BamHl和EcoRI的酶切住点之间,构建质粒pPHCV—Rz;用KpnI和 EcoRV双酶切后,将CTEeDNA定向插入表达栽体pPHCV-R.z多克隆位点中,构建成重组表达质粒,并用 酶切分析和序列测定进行了鉴定.结果酶切鉴定和测序证实tR_NA~启动子和HCV5-NCR区195住的核 酶基因以覆CTEcDNA被正确克隆入真核表达载体pPUK.结论tRNA~一CTE复合核酶真核表达栽体的成 功构建,为开展利用tR_NA~-CTE复合核酶切割HCVR.NA的研究奠定了基础. 关键词:核酶;D型逆转录病毒胞浆转运信号序列CTE;表迭栽体 中图分类号:Q781文献标识码:A ConstructionofeukaryoticvectoroftRNA,-CTEhybridribozyme JIANGYong—fang,GONGGuo-zhong,XUYan,HEYan,LIUBo (CenterforLiverDisease,SecondXiangyaHospital,CenteralSouth University,Changsha,Hunan410011,P.R.China) Abstract[Objective】ToconstructaneukaryoticexpressionvectoroftRNA试一CTEcombinedribozymeasabasis forfurtherstudy.【Methods】TheCTEcDNAwassyr~thesizedbyRT-PCRwiththespecificprimers.Theoligonu— cleotidelinkersencodingthesequenceofthetRNApromoterandKpnIandEcoRVandribozymetargeting195 siteofHCVNCRwereannealedandligatedintotheBamHI/EcoRIsiteofpPUR,wasdesignatedpPHCV-Rz.M- terrestrictionendonucleaseKpnIandEcoRVdoubledigestedit,thetargetfragmentwassubclonedintoeukaryotic vectorpPHCV—Rztoconstructeukaryoticexpressionrecombinant.Theexactitudeofrecombinevectorwasidentified bydigestionandsequencinganalysis.【Results】TherecombinantplasmidwiththetRNA-CTEhybridrebozyme wasconstructedsuccessfullybysequencinganalysisandbydigestionidentification.【Conclusions】Weconstructthe eukaryonexpressionvectorcontainingthetRNA~a-CTEhybridribozymegenesuccessfullywhichisthefoundation forfurtherstudy. Keywords:constitutivetransportelement;fibozyme;expressionvector 丙型肝炎病毒(HCV)是～正链RNA病毒,通 过核酶技术抑制HCV的复制和表达是近年来研究 的热点.然而核酶的作用受很多因素的影响,包括 镁离子的浓度,细胞内核酶的稳定性,核酶在细胞内 的分布以及靶RNA的空间构型阻碍核酶与之结合 等,其中靶RNA的空间构型成为目前影响普通核酶 在细胞内的切割效率最为关键和最难控制的因素. 为此我们设计了针对HCV5端非编码区(5-NCR) 结合D型逆转录病毒胞浆转运信号序列CTE(COil— stitutivetransportelement)的复合