CTLA4-Ig腺病毒基因局部转染诱导大鼠肾移植免疫耐受.docVIP

CTLA4-Ig腺病毒基因局部转染诱导大鼠肾移植免疫耐受 Mar.2007,27(1)实验动物与比较医学LaboratoryAnimalandComparativeMedicine竺 CTLA4.Ig腺病毒基因局部转染 诱导大鼠肾移植免疫耐受 平季根,严春寅,吕金星 (苏州大学附属第一医院泌尿外科,苏州215006) 【摘要】目的通过cn,A4一Ig腺病毒基因治疗诱导异基因大鼠之间的肾脏移植免疫耐受,并探讨 相关机制.方法以CTLA4一Ig基因重组腺病毒为载体,将CTLA4.Ig基因局部转染入SD大鼠肾 脏.将SD对Wistar大鼠原位肾移植模型分为三组:组I为空白对照组;组Ⅱ为EGFP空载体对 照组;组m为CTLA4一Ig基因转染组.观察大鼠存活时间及肾功能变化.结果组I移植肾存活 时间8.17±1.17d;组Ⅱ移植肾存活时间8.00±1.55d;组IⅡ存活时间31.33±6.77d.组Ⅲ存 活时间明显延长.转染组术后血清肌酐较同期对照组为低.结论CTLA4一Ig基因局部转染供肾 的基因治疗,可诱导异基因大鼠间的肾脏移植免疫耐受,延长肾脏移植物存活时间. [关键词】基因表达;移植;肾脏 [中图分类号】Q95—33[文献标识码】A[文章编号】1004—8448(2007)01—0045.03 共刺激分子阻断剂CTLA4一Ig是细胞毒T淋巴 细胞相关蛋1~t4(CTLA4)胞膜外区与免疫球蛋白IgG Fc段融合形成的可溶性重组融合蛋白,CTLA4一Ig 是一种新颖的免疫抑制剂,可竞争性抑制CD28与 B7结合,从而阻止共刺激信号的传递,使异体抗 原反应性T细胞处于无反应状态,延长移植物存活 的时间,并达到诱导免疫耐受的效果.与直接注 射重组蛋白相比,采用CTLA4一Ig转基因治疗能获 得更好的效果,可以在移植物局部持续产生调控分 子,既可维持局部的免疫抑制,又可减少对全身 的副作用.本实验用CTLA4一Ig基因局部转染大鼠 肾脏后进行同种移植,对CTLA4一Ig基因局部转染 诱导肾移植免疫耐受进行观察. 1材料与方法 1.1实验动物 清洁级雄性SD及Wistar大鼠,体重180~240g. 【收稿日期】200608.18 【作者简介】平季根(1965.),男,副主任医师.从事肾移植基 础及临床研究,ligang8882000@yahoo.tom.ca 由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供[SCXK (沪)2003—0003】. 1.2主要试剂 20%盐酸氯胺酮注射液(江苏恒瑞医药股份 有限公司);低分子肝素钠(瑞典法玛西亚普强公 司);腺病毒穿梭质粒pAdTrack—CMV,腺病毒辅 助质粒pAdEasy,携带绿色荧光蛋白(EGFP)基 因腺病毒质粒由上海东方肝胆外科医院基因研究 所惠赠;抗CTLA4一Ig胞外区单克隆抗体购自美国 SantaCruz公司. 1.3方法 1.3.1CTLA4一Ig腺病毒载体的构建按文献[1】进 行,先将CTLA4一Ig基因克隆至腺病毒穿梭质粒 pAdTrack-CMV中,然后再把该质粒同腺病毒辅助 质粒pAdEasyJ1]i过lipofectamine2000共转染至293细 胞,进行体外同源重组,用293细胞包装获得重 组腺病毒pAdCTLA4一Ig,最后经过空斑纯化和鉴定, 筛选出表达CTLA4一Ig的腺病毒载体,滴度为9× 109pfu/ml. 1.3.2袖套法大鼠原位肾移植模型的建立供 体为雄性SD大鼠,受体为雄性Wistar大鼠,具 !:———竺!:¨l竺!:!!竺 2结果 2.1重组腺病毒对移植肾的转染 免疫键光也洲!f=_【1利Ill移椅肾内柬 特异胜黄)组ll移精肾小特内IJ见ErJ显的特异 荧圯f图11 __-—■————] }_一. , ll^鼠好转植术后,穆植肾示踪标ld告基1 EGFP丧选的塘光照f×4001 图l大鼠肾组织免痤荧光检测 2.2移植肾存活时间 lI1赶鼠存活时(3I33±677d)峒K1【 l【和耋H1(8I7±117d椰800±I55d)【00_1 2.3大鼠肾移植后肾功能变化 术前择功能肯术}7dI刊圳【】 肾功能州『『lrj1.,0术ii;l比较,,lt;0o1组Il】J,鼠 术.i14d.血浦I]Jl浓恒jz忙后7diUJ升塌.fH 眠丁剁照m水(表l1 表1大鼠肾移植术前,术后血清肌酐浓度变化~lnlob 往:木舸比较.Pgt;0f)5.irJ期赴lI蛆ll Plt;Ool与组】术雁锦7d比辑m0I 24病理学检查 光镜.二纽杉植圩lYJHE也片均持 问质广泛的淋巴细胞浸I揪移}训BanffT 怍舒粪1:l和翎【】移植肾生Il_Il城f斥反应: 组ITT移世圩呈.一I级抓斥匣I 2.5免疫组化法检刑CTLA4.Ig在肾组织内的表达 纽IT1术后旃7