第3章 细胞生物学研究技术方法.pptVIP

第3章 细胞生物学研究方法;第一节 细胞形态结构的观察方法;一、光学显微镜(light microscope);（一）普通复式光学显微镜;显微镜最重要的性能参数是分辨率，不是放大倍数 分辨率是指能区分开两个质点间的最小距离;普通光镜观察的生物组织样品需要固定、包埋、切片、染色等;（二）相差显微镜 phase-contrast microscope;相差显微镜是在普通光学显微镜的基础上，添加两个元件，即“环状光阑”和在物镜后焦面上的“相差板”，从而可将这种光程差或相位差，通过光的干涉作用，转换成振幅差;（三）荧光显微镜 fluorescence microscope;荧光显微镜采用的光源、激发滤片、双分镜等与普通光学显微镜不同(或没有);荧光显微镜样品制备技术包括免疫荧光技术和荧光素直接标记技术 样品可以是荧光染料标记，也可以用可产生荧光的绿色荧光蛋白(GFP)的基因与编码某种蛋白质的基因相融合 ;（四）激光扫描共焦显微镜 laser scanning confocal microscope ;通过调节焦平面可获得一系列不同切面上的细胞图像，重构样品三维结构;二、电子显微镜 electron microscope EM;透射电子显微镜 transmission electron microscope TEM ;Philips EM Transmission Electron Microscope ;由于细胞厚度及细胞各部分对电子的通透差异不大，透射电镜细胞样品需要超薄切片以及重金属盐染色;1超薄切片技术 ultra thin section;应用超薄切片技术，几乎可以观察各种细胞的超微结构;2.负染色技术 negative staining;3.冷冻蚀刻技术 freeze etching;;4.电镜三维重构 three-dimensional restrcture;低温电镜技术样品不经固定、染色和干燥，直接包被在冰膜中，在电镜内-160 ℃低温下利用相位衬度成像 研究细胞和细胞器三维精细结构的电子扫描断层成像技术;5.扫描电镜技术 scanning electron microscope SEM;为了保证样品在扫描观察前不发生表面变形，通常需要利用CO2 临界点干燥法对样品进行干燥处理 样品在观察前还要喷镀一层金膜，以获得二次电子信号;;一、超离心技术分离细胞组分;二、细胞成分的细胞化学显示方法;三、细胞内特异蛋白抗原的定位与定性;（一）免疫荧光技术;（二）免疫电镜技术; 四、细胞内特异核酸的定位与定性;光镜水平的原位杂交技术 (同位素标记或荧光素标记的探针) 电镜水平的原位杂交技术 (生物素标记的探针与抗生物素抗体相连胶体金标记结合);五、流式细胞术(flow cytometry);一、细胞培养（一）动物细胞培养;（二）植物细胞培养;二、细胞工程;单克隆抗体技术：通过HAT 选择培养获得分泌单抗的杂交瘤细胞株;（二）显微操作技术与动物的克隆;转基因(GFP)鸡、猪;一、荧光漂白恢复技术 fluorescence photobleaching recovery FPR;二、单分子技术与细胞生命活动的研究;三、酵母双杂交技术 yeast two-hybrid sysytem;四、荧光共振能量转移技术(fluorescence resonance energy transfer FRET);五、放射自显影技术;对细胞或生物体内生物大分子动态研究和追踪的标记方法：持续标记、脉冲标记;第五节 模式生物与功能基因组的研究;原核细胞，培养方便，生长快，基因结构简单，突变株的诱变，分离和鉴定容易，转基因技术成熟，进行基因定位简便易行。;（二）酵母;（三）线虫(Caenorhabditis elegans);（四）果蝇(Drosophila melanogaster);（五）斑马鱼(Danio rerio);（六）小鼠(Mus musculus);（七）拟南芥(Arabidopsis thaliana);二、突变体制备技术;在DNA 水平: 基因敲除(knock out) 基因敲除技术在小鼠中的建立与应用为动物功能基因学和人类疾病小鼠模型作出了重要贡献;三、蛋白质组学(proteomics)技术;Thanks for yourattention!