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外源DNA导入哺乳动物细胞技术 绿色荧光蛋白(GFP)简介 外源质粒DNA导入原核细胞（细菌） ----转化（transformation） 外源质粒DNA导入真核细胞（哺乳动物细胞） ----转染（transfection） 磷酸钙转染法： CaCl2溶液+含Na2HPHO4的缓冲液+质粒DNA——沉淀 特点：溶液可自行配置、经济、适用于某些细胞（如293T细胞） 脂质体转染法： 商品化购得、成本较高、操作简便、适用细胞类型较广 电穿孔转染法： 购置特殊设备、操作简单、多适用于悬浮细胞、难转细胞 病毒颗粒侵染法： 操作周期长，适用细胞类型较广，尤其适用于难转染细胞系、原代细胞，转染效率高 显微注射法： 转基因动物制备，技术要求高 它之所以能够发光,是因在其包含238个氨基酸的序列中,第65至67个氨基酸(丝氨酸—酪氨酸—甘氨酸)残基,可自发地形成一种荧光发色团。 绿色荧光蛋白（green fluorescence protein, GFP) 　GFP吸收的光谱,最大峰值为395nm(紫外),并有一个峰值为470nm的副峰(蓝光);发射光谱最大峰值为509nm(绿光),并带有峰值为540nm的侧峰(Shouder). 　　 尽管450～490nm(蓝光)是GFP的副吸收峰,但由于长波能量低,细胞忍受能力强,因此更适合于活体检测. GFP的光谱特性与荧光素异硫氰酸盐(FITC)很相似,因此为荧光素FITC设计的荧光显微镜滤光片组合同样适用于GFP观察.　　 GFP的属性 2008年10月8日下午5点45分，2008年诺贝尔化学奖揭晓，三位美国科学家，美国Woods Hole海洋生物学实验室的Osamu Shimomura（下村修）、哥伦比亚大学的Marin Chalfie和加州大学圣地亚哥分校的Roger Y.Tsien（钱永健，钱学森的堂侄）因发现并发展了绿色荧光蛋白（GFP）而获得诺贝尔化学奖！ 1994年起，钱永健开始研究GFP，改进GFP的发光强度，发光颜色（发明变种，多种不同颜色），发明更多应用方法，阐明发光原理。世界上应用的FP，多半是他发明的变种。他的专利有很多人用，有公司销售。 　　钱永健的工作，从八十年代一开始就引人瞩目。他可能是世界上被邀请给学术报告最多的科学家，因为化学和生物都要听他的报告，既有技术应用、也有一些很有趣的现象。他1952年出生，年龄允许等很多年（而80高龄的下村修没有这个优势）。所以，钱永健多年被很多人认为会得诺贝尔奖，可以是化学、也可以是生理奖。 钱永健的科学贡献： （CFP、 GFP、YFP、 RFP） 1. Promoter活化强度研究—— 用作 报告基因 GFP在生命科学中的应用： 利用GFP指示目的基因是否转入实验动物 3. FRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer) （CFP、 GFP、YFP、 RFP）