生物化学实验氨基移换作用谷丙转氨酶活性的测定.pptVIP

实验: 氨基移换作用—谷丙转氨酶活性的测定 一 目的 学习血清中谷丙转氨酶活性测定的方法。 二 原理 α-酮戊二酸和丙氨酸在pH7.4时，经谷丙转氨酶（GPT）的催化生成丙酮酸和谷氨酸。丙酮酸与2,4—二硝基苯肼作用生成丙酮酸2,4—二硝基苯腙在碱性溶液中呈棕红色，可在波长520nm处进行比色。2,4—二硝基苯肼为羰基试剂，也能与反应液中的α-酮戊二酸作用，生成α-酮戊二酸2,4—二硝基苯腙，在相同条件下的比色吸光值远远小于丙酮酸2,4—二硝基苯腙的吸光度。丙酮酸的成色物质，在波长520nm处的吸光度值与丙酮酸的含量成正比。 血清中GPT的活性以“King氏单位”表示。即100mL 实验方法与步骤 取干试管五支，标号后按下表操作： 五 结果与分析 D样品 100 GPT单位% = ×0.4× D标准 0.2 六 注意事项 在样品空白中加入0.2mL血清的目的在于抵销血清样品中正常代谢的已经存在的少量丙酮酸。 七 思考题 1.?什么叫转氨基作用？ 2.测定哪些转氨酶的活性在临床诊断上有重要意义？ 3.为什么测定中存在的α-酮戊二酸几乎不影响丙酮酸的测定？ ? 分光光度计的使用 1.接通电源，开盖预热20分钟。 2.仪器调零：开盖、用零旋钮调仪器显示零。 3.调100：先调波长，从里向外放入试剂空白和测定液，闭盖，选择T模式，用试剂空白和100旋钮调仪器显示100。以上旋钮不准动。 4.调吸光度为零：选择吸光度（A）模式，此时试剂空白应显示0.00，否则，可用消光选钮调至0.00。 5.测定：抽拉杆至响声停，即显示第二测杯中的吸光值。记录数据。再抽拉杆至响声停，即显示第三测杯中的吸光值。再抽拉杆至响声停，即显示第四测杯中的吸光值。 注意：在测定过程中，只拿出测定液，而试剂空白 不能拿出，始终作为空白调零之用。 关于其他分光光度计的使用：1、2条是共同的，3、4、5条是通过模式选择、接着按键来达到目的。 实验： 植物总DNA的提取 植物总DNA的提取方法很多，因研究目的和生物材料的不同方法各异。本实验介绍 II CTAB法。 一、目的 学习和掌握从植物材料中提取总DNA的原理与方法。 二、原理 CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)是一种阳离子去垢剂，它可以溶解膜与脂膜，使细胞中的DNA-蛋白质复合物（DNP）释放出来，并使蛋白质变性，使DNA与蛋白质分离。然后再用含少量异戊醇的氯仿去除蛋白质，并用异丙醇选择性地把大分子DNA从抽提液中沉淀出来，除去小分子RNA和其它杂质。 本方法可适用于植物幼嫩材料DNA的微量提取。 三、材料、仪器和试剂 1．材料：小麦幼芽。 2．仪器：①离心机 ②水浴锅③研钵 ④微量移液器 3．试剂：2×CTAB提取液等 四、操作步骤 1．取小麦嫩芽，用清水清洗干净，去掉表面污物，然后自然凉干或用纱布、卫生纸吸干表面残留的水份，切莫让叶片组织失水萎蔫，迅速用于实验。 2．取2g小麦叶片组织于研钵内，加一药匙石英砂和2 mL 2倍CTAB提取液，迅速研磨。目的是破碎组织，而不破碎细胞。（最好在-20℃下研磨）。 3．将研磨液转入1.5mL离心管中，到1mL处（2/3）。 4．置于60℃水浴中保持30min，每隔10min颠倒几次离心管。目的是充分反应，破碎细胞。 5．离心5min(10000r/min,4℃)，取上清夜转到另一离心管中。（约700μL） 6．加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1）混合液（满离心管），摇动混合3min。 7．15000r/min离心5min。（去除沉淀的蛋白质） 8．将上层液移入新的1.5mL离心管内，加600μl异丙醇。颠倒离心管几次，此时可见DNA絮状沉淀。 9．15000r/min离心0.5min。倒掉上清夜，将离心管倒置于滤纸上干燥。 10．用吸水纸吸去液滴（灭菌纸），加800μl 75% 乙醇和10mmol/L醋酸铵。 11．轻轻颠倒离心管几次，将沉淀于底部的DNA弹起，放置离心管30min或更长。 12．10000r/min，离心0.5-1min。倒掉上清夜，将离心管倒置于滤纸上干燥。 13．用吸水纸吸去液滴（灭菌纸），加800μl 75% 乙醇，轻轻颠倒离心管几次，放置30min或更长。 14．15000r/min，离心3min。除去上清液，干燥3小