临床+第十四章讲+基因工程及常用分子生物学技....ppt

核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization) 在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链(heteroduplex) 。 （一）分子杂交与印迹技术的原理 复性 RNA DNA 1、印迹技术 利用各种物理方法使电泳胶中的生物大分子转移到NC等各种膜上，使之成为固相化分子。 用放射性核素、生物素或荧光染料标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸链被称为“探针”，探针可以与固定在NC膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。 2、探针技术 NC膜 DNA或RNA 探针 （二）印迹技术的类别及应用 1、DNA印迹 (Southern Blotting) 2、RNA印迹 (Northern Blotting) 3、蛋白质的印迹 (Western Blotting) 用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。 用于RNA的定性定量分析。 用于蛋白质定性定量及相互作用研究。 分子杂交实验 ① ② ③ 二、聚合酶链反应 (polymerase chain reaction, PCR) 末代沙皇尼古拉II 1918年的流行性感冒病毒 电影《侏罗纪公园》 辛普森杀妻案 （一）PCR 的故事 上述四件事情到底有什么相关呢？ 然而近二十几年来生物技术的一项新发明，把它们给连在一块了。这项技术就是“聚合酶链反应”（polymerase chain reaction，PCR） 答案是NO! PCR最大的特点是能将微量的DNA大幅增加。因此，无论是化石中的古生物、历史人物的残骸，还是几十年前凶杀案中凶手所遗留的毛发、皮肤或血液，只要能分离出一丁点的DNA，就能用PCR加以放大，进行比对。这也是“微量证据”的威力之所在。 PCR的发明人，一般公认是穆里斯（K. Mullis），他因此获得了1993年的诺贝尔化学奖。 Kary Banks Mullis the Pacific Coast Highway PCR的点子，据穆里斯的说法，那是在1983年春天的一个周五晚上，他开车带着女友前往乡间的小屋度周末。在蜿蜒的乡间公路上开着车，一段DNA反复复制的景像，在他的脑海里冒了出来。穆里斯原以为这样简单的想法，应该有人提出过，但搜索文献后却发现没有。 变性 95 ?C 延伸 72 ?C 退火 Tm-5 ?C 1. PCR的基本反应步骤 （二）PCR技术的工作原理及应用 模板DNA 特异性引物 耐热DNA聚合酶 dNTPs Mg2+ 2.PCR体系基本组成成分 黄石公园的热泉 1973年台湾科学家钱嘉韵从黄石公园热泉里一种嗜热菌中成功分离出耐高温的Taq DNA聚合酶。 Thermus aquaticus 5? Primer 1 5? Primer 2 Cycle 2 Cycle 1 5? 5? 5? 5? 5? 5? Template DNA 3. PCR技术的工作原理 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? Cycle 3 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 25～30 次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。 目录 治疗侏儒症的唯一方法：向患者注射生长激素。 加拿大袖珍女童肯娜迪(4岁，66厘米高)就像父亲手中的“玩具洋娃娃”。 侏儒症 现在利用基因工程方法：将人的生长激素基因导入大肠杆菌中，使其生产生长激素。人们从 450 L大肠杆菌培养液中提取的生长激素，相当于6万具尸体的全部产量。 450L大肠杆菌培养液提取的生长激素相当于6万具尸体的全部产量 解剖提取法 基因工程法 耗财 耗时 6万X8千=4.8亿 几十万 至少一年 最多半个月 第十四章 基因工程及常见分子生物学技术 第一节 重组DNA技术 DNA Recombination Technique is also Called DNA Cloning or Molecular Clone 一、重组DNA技术相关概念 （一） DNA克隆（DNA cloning） 是指应用酶学的方法将目的基因和载体重组，再导入受体细胞内进行扩增和表达的过程，也称重组DNA技术或基因克隆。 基因工程(genetic engineering) 实现基因克隆所用的方法及相关的