2017_2018学年度高中生物专题5DNA和蛋白质技术课题2多聚酶链式反应扩增DNA片段练习新人教版选修.docVIP

课题2多聚酶链式反应扩增DNA片段 PCR扩增的原理和过程 [自读教材·夯基础] 1．细胞内DNA复制的条件 原料 4种脱氧核苷酸 模板 2条DNA母链　 酶 解旋酶和DNA聚合酶 引物 使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 2．PCR扩增的原理及条件 (1)PCR技术：即多聚酶链式反应，是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。它能以极少量的DNA为模板，在短时间内复制出上百万份的DNA拷贝。 (2)引物：DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3′端延伸DNA链，因此，DNA复制需要引物。 (3)扩增方向：总是从子链的5′端向3′端延伸。 (4)原理：DNA的热变性原理，即： 双链DNA单链DNA (5)条件 3．PCR的反应过程 (1)过程： (2)结果：DNA聚合酶只能特异地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。 1．DNA复制时为什么需要引物？ 提示：DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3′端延伸DNA链。 2．PCR扩增DNA过程中是否还需要解旋酶？ 提示：不需要。 3．PCR缓冲液相当于细胞内的什么成分？ 提示：因为缓冲液为DNA的复制提供场所，相当于细胞内DNA复制的场所，所以缓冲液相当于核基质。 4．PCR循环之前，常要进行一次预变性，预变性的目的是什么？ 提示：预变性的目的是增加大模板DNA彻底变性的概率。 5．利用PCR技术扩增1个DNA分子n次，所得DNA分子中，不含引物的脱氧核苷酸链所占的比例是多少？含引物的DNA分子所占的比例是多少？ 提示：1/2n；100%。 [跟随名师·解疑难] 1．细胞内DNA复制与体外DNA扩增(PCR技术)的比较 项目 细胞内DNA复制 PCR 不同点 解旋 解旋酶，边解旋边复制 80～100 ℃高温解旋，双链完全分开 酶 DNA解旋酶、DNA聚合酶、DNA连接酶 TaqDNA聚合酶 引物 RNA DNA或RNA 温度 体内温和条件 高温 子链合成 一条链连续(先导链)，另一条链不连续，先合成片段，再由DNA连接酶连接(滞后链) 两条子链均连续合成 相同点 ①提供DNA模板 ②四种脱氧核苷酸作原料 ③子链延伸的方向都是从5′端到3′端 2．PCR反应过程 (1)变性：当温度上升到90 ℃以上时，双链DNA解聚为单链，如图： (2)复性：系统温度下降至50 ℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，如下图： (3)延伸：当系统温度上升至72 ℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸(A、T、G、C)在DNA聚合酶的作用下，据碱基互补配对原则合成新的DNA链，如下图： [特别提醒]PCR反应的结果 ①PCR一般要经历三十多次循环，每次循环都包括变性、复性、延伸三步。 ②两引物之间的固定长度的DNA序列呈指数扩增。 实验操作及DNA含量的测定 [自读教材·夯基础] 1．实验操作程序 2．DNA含量的测定 (1)原理：利用DNA在260_nm的紫外线波段的吸收峰曲线来测定相应含量。 (2)计算公式：DNA含量(μg/mL)＝50×(260 nm的读数)×稀释倍数。 [跟随名师·解疑难] 1．实验操作注意事项 (1)为避免外源DNA等因素的污染，实验中使用的一些用具在使用前必须进行高压灭菌。 (2)所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在－20 ℃储存。 (3)在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头必须更换。所有成分都加入后，通过手指轻轻弹击管的侧壁，使反应液混合均匀。 2．结果分析与评价 DNA在260 nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，可以利用DNA的这一特点进行DNA含量的测定，以判断DNA片段的扩增是否成功。具体方法如下： (1)稀释：取2 μL PCR反应液，加入98 μL蒸馏水，即将样品进行50倍稀释。 (2)对照调零：以蒸馏水作为空白对照，在波长260 nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零。 (3)测定：取DNA稀释液100 μL至比色杯中，测定260 nm处的光吸收值。 (4)计算：检测DNA片段的扩增情况，可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果，计算公式为： DNA含量(μg/mL)＝50×(260 nm的读数)×稀释倍数 如果扩增不成功，则要分析失败原因。可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。 [特别提醒]　公式中的50代表在波长260 nm紫外波段照射下，吸收峰为1时，DNA含量为50 μg/mL。 PCR技术的原理 [例1] 多聚酶链式反应(PCR)是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。PCR过程一般经历下述三十多次循环：95 ℃下变性(使模板DNA解旋)→55 ℃下复性(引物与DNA模板链结合)→72