第十章酶的催化机理-149.ppt

* * 几种酶的共价催化 亲核共价修饰反应 乙酰乙酸脱羧酶的亲核催化 磷酸吡哆醛的亲电催化 蛋白酶的催化机制 肽键水解在热力学上是十分有利的，但若无蛋白酶的催化，1个肽键在中性pH和25℃条件下约需300~600年的时间才能完成水解。 根据活性中心催化基团的性质，蛋白酶可分为四类：（1）丝氨酸蛋白酶——此类蛋白酶的催化基团包括1个不可缺少的Ser残基，DIFP是它们的不可逆抑制剂；（2）金属蛋白酶——这类蛋白酶在活性中心结合有金属离子，其活性绝对需要金属离子，故金属离子螯合剂可导致活性的丧失；（3）天冬氨酸蛋白酶——其催化基团包括2个Asp，在偏碱性的pH下无活性；（4）巯基蛋白酶——其催化基团包括1个Cys的巯基，碘代乙酸为它们的不可逆抑制剂。 所有蛋白酶在催化中都经历四面体的过渡态，该过渡态形成的原因是反应涉及一个亲核基团进攻肽键的羰基碳。若是丝氨酸蛋白酶和巯基蛋白酶，进攻的亲核基团分别是Ser残基的羟基和Cys残基的巯基，否则就是水分子。 丝氨酸蛋白酶 这类蛋白酶以一个特定的Ser残基作为必需的催化基团，属于该家族成员的有胰蛋白酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、激肽释放酶原、凝血酶、纤溶酶等。 丝氨酸蛋白酶的催化机制属于共价催化和广义酸碱催化的混合体，还有氧阴离子穴对过渡态的稳定，由3个不变的Ser、His和Asp残基构成的催化三元体起主导作用，这3个氨基酸任何一种突变或修饰均可导致酶活性的丧失。　　　 构成催化三元体的3个氨基酸在催化中的具体功能是： Ser195充当进攻底物的亲核基团 His57作为广义的酸碱催化剂 Asp102 的功能仅仅是定向His57，影响His的 pKa，改变其酸碱性质。 胰蛋白酶具有很深的底物结合口袋，口袋的底部又是Asp，特别适合长Lys和Arg的结合；糜蛋白酶的底物结合口袋没有胰蛋白酶深，但比它宽，而且口袋壁分布的是疏水氨基酸，故特别适合芳香族氨基酸的结合；弹性蛋白酶的底物结合口袋非常浅，最适合结合侧链较小的氨基酸。 丝氨酸蛋白酶的催化三元体 丝氨酸蛋白酶的作用机制 多肽底物 丝氨酸蛋白酶的作用机制 丝氨酸蛋白酶的作用机制 丝氨酸蛋白酶的作用机制 水分子的亲核进攻 丝氨酸蛋白酶的作用机制 丝氨酸蛋白酶的作用机制 酶恢复到原来的状态 N端产物释放出来 丝氨酸蛋白酶的作用机制 胰凝乳蛋白酶催化的四面体中间物的形成及其稳定 酶催化反应机制实例 1、溶菌酶 破坏细菌细胞壁上肽聚糖的酶，能水解N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡糖胺之间的糖苷键。 酶的活性部位位于它的狭长的缝隙之中。 卵清溶菌酶一级结构 C1 C4 四、酶催化反应机制实例 溶菌酶的催化机制 酶的最适底物是暴露在细胞壁外由NAG-NAM交替出现的六糖单位。 酶的作用部位：第四位NAM和第五位NAG之间的糖苷键。 C-1 氧阴离子 pKa（侧链羧基）＝4.5 pKa（侧链羧基）＝5.9 pH＝5.2时 Asp发生电离；Glu35质子化 。 带负电的Asp52通过静电吸引能稳定C-1位显现的正电荷；质子化的Glu35能同氧阴离子形成氢键，或供出一个质子和它的电荷。 氧碳之间的键断开所需的活化能减小，糖苷键进入转换态，可很快被水解。 水解位点 2、丝氨酸蛋白酶 二异苯氟磷酸是该酶的不可逆抑制剂 催化三联体 酶的活性部位：小口袋状凹陷。 专一性的侧链契入到疏水口袋，催化Asp102指向His57，通过氢键使其稳定；酶与底物的相互作用使敏感键的羰基定向，接近Ser195的氧原子部位。 活性部位 氧阴离子洞 疏水口袋 多肽底物 氢键 底物氧阴离子的形成使转换态同酶的结合比同底物的结合更紧密。 His57从Ser195的羟基上取走质子，同时底物肽键上的羰基受到Ser195的氧的亲核攻击，形成转换态；此时肽键上的羰基由双键变成较长的C－O单键，允许该四面体中间物带负电的氧进入氧阴离子洞位置；氧阴离子与Ser195和Gly193的主链上的酰胺形成氢键。 来自底物肽键的羧基与酶形成共价键，生成酰基－酶中间物。 His57的咪唑基（酸催化剂）为底物的敏感键上的N原子提供一个质子，使肽键断裂，第一个胺产物释放； 水分子进入。 水分子提供质子给His57，同时提供OH-攻击羰基碳，酰基酶中间物脱酰化。 第二个四面体中间物形成并被氧阴离子洞稳定。 质子化的His再次供出一个质子，导致第二个四面体中间物的瓦解，并形成具新的羧基的第二个产物。 游离的酶重新形成。 三联体 影响反应障碍活化能的主要物理、热力学因素： 酶作用 1)熵变 邻近效应 熵减 2)水化层 底物与酶之间弱键的形成导致底物去溶剂化 3)底物形变（电子重排） 结合能补偿形变能量变化 4)功能基团在酶分子上的正确排布 诱导契合 * * * * 第十章 酶的催化机制 提纲 一、酶催化机理研究的主要方