纤维素酶活力的测定-唐志强.pptVIP

纤维素酶活力的测定 二O一一年三月 一、目的和内容 目的：了解纤维素酶的种类和测定原理，掌握 其活力的测定方法。 内容：测定并计算纤维素酶的活力。 * * * * 指导教师：孙运军 研究生：唐志强 胡展 二、基本原理 1. 纤维素酶是一类分解纤维素的复合酶，目前公认的有四种:（1）内切β-1,4-葡聚糖酶；（2）外切β-1,4-葡聚糖酶；（3）纤维二糖水解酶；（4）纤维二糖酶（β-葡聚糖苷酶）。 纤维素酶液中各种酶的作用方式图 2. 纤维素酶水解纤维素产生的纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将碱性条件下的3,5-二硝基水杨酸（DNS）还原，生成红棕色的氨基化合物，在540nm波长处有最大光吸收，在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度呈比例关系，利用比色法测定其还原糖生成的量就可测定纤维素酶的活力。 由不同底物测得的酶活力分别称作FPA (滤纸糖酶活力) 和CMCA (羧甲基纤维素酶活力)。 DNS与还原糖的反应 540nm CMCNa 羧甲基葡萄糖 氨基化合物(红棕色) 纤维素酶 测定吸光值 DNS试剂 50℃,30min 沸水浴5min 为了统一标准，目前通常以羧甲基纤维素钠盐（简称CMCNa）作为纤维素酶作用的底物。但需要指出的是CMCNa无论在结构上（见图）还是在性质上都不同于天然纤维素，天然纤维素不溶于水，而CMCNa有很强的亲水性，非常容易被纤维素酶分解。在相同条件下，同一种纤维素酶分解CMCNa所产生的还原糖远大于水解天然纤维素所产生的还原糖。 纤维素酶水解羧甲基纤维素钠（CMCNa,[C6H9O5 (CH2COONa)]n）释放的羧甲基还原糖，与碱性条件下的DNS试剂发生反应，生成红棕色的氨基化合物，该化合物在540nm下有最大光吸收，由此，可根据测得的吸光值与葡萄糖浓度的关系来计算纤维素酶的活力（CMCA）。 羧甲基纤维素钠的结构 1.器材：水浴锅、分光光度计、记时器、 比色管（4支+6支）、移液管（5支）、吸耳球 2.试剂（公用）： ⑴ 蒸馏水 ⑵ DNS试剂 1416ml蒸馏水，10.6g 3,5-二硝基水杨酸和16g NaOH混合并溶解，加酒石酸钾 钠306g，苯酚（加热溶解）7.6ml，亚硫酸钠8.3g。 ⑶ 2%羧甲基纤维素纳水溶液（CMCNa） ⑷ 纤维素酶液（酶液A、酶液B） A：15mg/ml纤维素酶水溶液用0.05M（pH=4.5）柠檬酸缓冲液稀释10倍。 B：15mg/ml纤维素酶水溶液用0.05M（pH=4.5）柠檬酸缓冲液稀释20倍。 ⑸ 1mg/ml标准葡萄糖溶液 三、器材和试剂 四、操作步骤 1. 标准曲线的制定 取6支25ml比色管，按表1分别吸取标准葡萄糖溶液和DNS试剂，沸水浴5min，冷却，然后加蒸馏水定容至25ml，用蒸馏水调零，于540nm处测光密度值。以葡萄糖的含量为横坐标，以OD540nm 为纵坐标，绘制标准曲线。 3 1.0 6 3 0.8 5 3 0.6 4 3 0.4 3 3 0.2 2 0 3 0 1 OD540nm 混 匀 后 沸 水 浴 5 min 加入DNS试剂体积（ml） 加入1mg/ml葡萄糖标准溶液体积（ml） 管 号 表1 葡萄糖标准曲线的制定 2. 酶活力的测定： (1)测定：取两支25ml比色管，作好标记（A和B），分别加入酶液A和酶液B各0.5ml，再加入已经预热的2%羧甲基纤维素纳（CMCNa）0.5ml ，混匀，50℃保温30min，然后加入3ml DNS试剂，于沸水中水浴5min（显色），冷却，加入蒸馏水定容到25ml，摇匀后，在540nm处测定光密度值OD540nm。 (2)对照：取两支25ml比色管，作好标记（A和B），分别加入酶液A和酶液B各0.5ml，沸水浴中放置5~10 min，然后加入底物（2% CMCNa）0.5ml 、DNS试剂3ml，并煮沸5min，冷却，加入蒸馏水定容到25ml，摇匀后，在540nm处测定光密度值OD540nm。 3.酶活力的计算 以国际单位（IU）为标准，在上述条件下，纤维素酶每分钟催化羧甲基纤维素纳水解生成1μmol葡萄糖的酶量定义为一个活力单位。 1ml纤维素酶溶液的活力单位数： CMCA= K×△OD540nm×N /（0.18×0.5×30） K ——常数，由标准曲线得出，数值上等于OD为1 时所相当的葡 萄糖的毫克数（mg）； △OD540nm——样品测定与空白实验的吸光值