2 2 4 4四溴联苯醚通过孕烷受体pxr介导的甲状腺毒性作用机制研究 word格式.docx

2,2,4,4-四溴联苯醚（BDE-47）通过孕烷受体介导的甲状腺毒性作用机制研究研究生：刘早玲导师：刘继文教授 张建清主任医师中文摘要目的：多溴联苯醚（Polybrominated diphenyl ethers，PBDEs）作为阻燃剂广泛用 于工业产品和家庭消费品中，其共有209种同系物，是正在受到全球关注的持久性有 机污染物。PBDEs主要对人和动物产生甲状腺毒性、神经毒性、生殖毒性和内分泌 干扰作用，对实验动物还有致癌性。由于甲状腺激素在中枢神经系统的分化、发育 及各种功能的形成过程中发挥关键作用，因此PBDEs的甲状腺毒性作用，可进一步 影响神经和内分泌等系统。迄今的研究结果发现，2,2’,4,4’-四溴联苯醚（BDE-47） 是目前分布最广、生物材料中含量最高、对生物和人体毒性最强的PBDEs同系物之 一，但其破坏甲状腺激素稳态等一系列分子机制还不清楚。本研究应用野生型小鼠 研究模型以及人肝癌HepG2细胞株PXR驱动的萤光酶启动子报告基因（PXR driven firefly luciferase reporter gene）检测系统，从体内和体外研究两个层面，通过BDE-47 对甲状腺激素合成和代谢过程的关键酶及其基因的影响以及BDE-47对甲状腺激素受 体、孕烷受体诱导作用的研究，探讨BDE-47甲状腺毒性作用机制。方法：体内实验选用SPF级、雌性C57BL/6小鼠60只，体重18～20g，按体重随 机分为6组，包括阴性对照组（玉米油C组）、孕烯醇酮16α-腈（PCN）（P组）、1,4- 双[2-（3,5-二氯吡啶氧）]苯（TCPOBOP）（T组）两个阳性对照组以及低（L）、中（M）、 高（H）三个BDE-47染毒剂量组，阴性对照组给予玉米油，阳性对照组分别按50mg·kg-1·d-1 和 3mg·kg-1·d-1 给予 PCN 和 TCPOBOP ，染毒组分别按 0.5mg·kg-1·d-1 、 5mg·kg-1d-1和50mg·kg-1d-1剂量给予BDE-47。6组动物按0.1ml·10g-1d-1连续4天腹腔注射 后，小鼠肝门静脉取血，迅速分离肝脏和甲状腺组织，进行下述研究：1．BDE-47 甲状腺毒性效应研究：采用电化学发光免疫法检测血清中总甲状腺 激素（TT3、TT4），和促甲状腺激素（TSH）水平。2．BDE-47 对孕烷受体（PXR）诱导作用的研究：（1）体内研究：采用实时荧光定量 PCR 检测技术（Real- Time PCR）和蛋白印 记法（Western Blot），从转录和蛋白表达水平检测肝脏 CYP3A11（PXR 在体内激活 的标志物）和 CYP2B10（组成型雄烷受体 CAR 在体内激活标志物）基因表达；（2）体外研究：构建人体肝癌 HepG2 细胞株 PXR 驱动的萤光素酶启动子报告 基因检测系统，利用该系统，进行下述研究：1）应用萤光素酶活性法测定 BDE-47 对高表达细胞株诱导 PXR 受体活性的能力；2）应用 Real-Time PCR 和 Western Blot 法测定 CYP3A4 基因 mRNA 水平和蛋白表达。3．BDE-47 所诱导的甲状腺毒性作用机制研究：（1）CHOPRA 法测定肝脏中 I 型脱碘酶活性（DI）；（2）Real-Time PCR 和 Western Blot 法测定肝脏中甲状腺激素受体 TRα1 和 TRβ1表达；（3）愈创木酚法测定甲状腺组织中甲状腺过氧化物酶（TPO）活性；（4）采用 Real- Time PCR 法测定小鼠肝脏中尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶UGT1A1 和硫酸转移酶 SUT1A1mRNA 表达变化。结果：（1）染毒期间各组小鼠饮水、饮食正常，终末体重没有显著差异，且未 发生小鼠死亡情况。与阴性对照组相比，P 组和 T 组 TT4 和 TT3 水平明显下降（P＜0.01），分别降低了 24%、25%和 40% 、46%；L、M、H 三个 BDE-47 剂量组小 鼠血清中 TT4 水平也明显下降（P＜0.01），分别降低了 18%、21%和 34%；除 L 组 TT3 水平没有变化（P＞0.05）外，M、H 剂量组 TT3 水平下降显著（P＜0.01），分 别降低了 10%和 30%。各受试物剂量组 TSH 水平均无变化（P＞0.05）。（2）各组小鼠肝脏组织 CYP3A11 和 CYP2B10mRNA 和蛋白表达如下：PCN 和 TCPOBOP 两个阳性对照组及 L、M、H 三个 BDE-47 剂量组小鼠肝脏 CYP3A11mRNA 和蛋白表达均上调，分别为 C 组的 2.1、2.7、2.5、3.3、4.5 倍（P＜0.05）和 1.8、2.5、 1.4、2.3、3.6 倍（P＜0.05）；TCPOBOP 组和 B