筛查方法建立凝聚胺鱼精蛋白聚乙二醇法.pptVIP

谢进荣 献血者不规则抗体筛查方案 主题内容 一、献血者不规则抗体筛查的临床意义； 二、筛查方法比选； 三、快速筛查方法建立； 四、快速筛查方法结果验证 一、献血者不规则抗体筛查的临床意义； 不同观点： 1、效价低，筛查效率低、筛查成本高，不用筛； 2、0.3%－2%阳性率，对婴幼儿输血或低温麻醉患者产生影响，应进行筛查。 国外多数国家还是筛查。AABB、英国输血服务机构指南 一、献血者不规则抗体筛查的临床意义 meta近年来的部分文献发现：献血者不规则抗体IgM约占85%，IgG约占10%， IgM/IgG混合抗体约占5%左右，效价多数在1：2－1：32（约占90%），少部分在1：64－1：128（约10%），大于1：128仅少数，个别甚至达1024。 按《输血技术规范》，血浆为相容性输血，若有不规则抗体，对小儿输血存在很大，既是成人输血，也可能存在潜在危害。 筛查阳性血浆，分离浓缩后，是非常宝贵的鉴定抗原血清。 一、献血者不规则抗体筛查的临床意义 二、筛查方法比较 献血者样本量集中：筛查方法选择批量化（自动化）、简便、快速、经济的方法。 二、筛查方法比较 目前常用方法，利用现有酶免检测设备或全自动血型仪开展相应检测，方法有： 盐水微板法 固相微板法 木瓜酶微板法 凝聚胺微板法 鱼精蛋白－聚乙二醇微板法 全自动凝胶法等 二、筛查方法比较 红细胞和血清在盐水溶液中直接反应 特点是操作简便，设备简单，缺点是影响因素多，灵敏度低，仅对IgM敏感。 盐水微板法 固相微板法 原理 洗涤 洗去未结合的血清蛋白 包被 将筛选细胞包被吸附在固相载体表面 反应 加入待测抗体 洗涤 使未结合在固相上细胞去除 1 3 2 4 固相微板法 原理 结果 反应 加入抗人球蛋白 反应 加入已致敏红细胞 洗涤 洗去未结合的抗人球 5 7 6 8 固相微板法：筛选细胞固相、孵育、洗涤，方法烦琐、操作时间长、生物安全/交叉污染； 酶法 利用木瓜酶或菠萝酶破坏红细胞表面唾液酸，使红细胞失去电荷，缩小细胞间距离 同时改变红细胞膜表面结构，使某些隐蔽的抗原暴露，从而增强凝集反应，破坏 MNSs、Duffy系统抗原； 凝聚胺法 利用多聚季胺盐在介质溶液中产生大量正电荷中和红细胞表面的负电荷，减少红细胞间排斥，促进凝集。弃液交叉污染，对抗－Lea、抗－K可能会漏检； 凝聚胺微板法 鱼精蛋白/聚乙二醇微板法 鱼精蛋白带正电荷，溶解后产生大量阳离子，可中和红细胞表面的阴离子 层 ，从 而 使 红 细 胞 间 距 缩 短，有利于IgG 抗 体 与 红 细胞 表 面相 应抗 原 特 异结 合 ．再 通 过 离 心 力的作用 而 产生 红细胞 凝集 ，从而检 出相应抗 体 ，聚 乙二醇可促进反应物之间的碰撞和免疫复合物形成从而提高灵敏度。特点是相对缩短抗原抗体反应时间，提高反应灵敏度 抗人球蛋白法 在盐水凝集法的基础上，加入抗人球蛋白抗体，通过抗人球蛋白抗体的特异性桥连作用，促进红细胞的凝集 抗人球法 凝胶卡式法 将红细胞和血清加在凝胶上部反应，离心后观察凝集的红细胞，被阻挡在小柱中凝胶的上部或中央，判断凝集反应阳性．游离的红细胞，被挤过装有过滤介质的小柱，而到达小柱的底部，判断凝集反应阴性，但是成本高。 三、快速筛查方法建立 筛查效率高，快速 不增加设备，利用现有资源 尽可能降低筛成本 改良鱼精蛋白/聚乙二醇微板法 三、快速筛查方法建立 凝聚胺/鱼精蛋白/聚乙二醇法配方：在调整原配方比例，加入一定量的凝聚胺，先用蒸馏水配制鱼精蛋白/聚乙二醇储存液： 硫酸鱼精蛋白0.1%，聚乙二醇20% ，白蛋白20%，葡萄糖4%，草酸钠0.5%.另有低离子配制凝聚胺溶液0.03%为储存液，用时按一定比例混合成筛查应用液。 三、快速筛查方法建立 鱼精蛋白/凝聚胺/聚乙二醇法原理：聚乙二醇破坏水化层促进抗原抗体反应物之间的碰撞和免疫复合物形成机会；鱼精蛋 白带正电荷 ，凝聚胺(Po1ybrene)也是一种高价阳离子，溶解后产生大量阳离子，可中和红细胞表面的阴离子 层 ，使红细胞Zeta电位降低，缩短红细胞之间的距离， 有利于IgG 抗 体 与 红 细胞 表 面相 应抗 原 特 异结 合 ， 通 过 离 心 力的作用 而 产生 红细胞 凝集 ，从而检 出相应抗 体 。白蛋白亦可促进免疫反应， 葡萄糖主要是维持溶液一定的渗透压 ，防止溶血 ，草 酸钠 通过 离子 作 用而 中和鱼精蛋白的非特异反应。 三、快速筛查方法建立 凝聚胺/鱼精蛋白/聚乙二醇法：调整配方后，形成互补，缩短反应时间，同时提高敏感度，由原来的15分钟缩短为1分钟。 三、筛查方法建立 凝聚胺/鱼精蛋白/聚乙二醇法：用EVO加样仪取献血者血清或血浆50ul，分别加25ul筛选细胞，加100ul凝聚胺/鱼精蛋白/聚乙二醇试剂