Confocal原理应用.ppt

共聚焦激光扫描显微镜 confocal laser scanning microscope, CLSM 激光共聚焦扫描显微境 用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描。 能显示细胞样品的立体结构。 分辨力是普通光学显微镜的3倍。 用途类似荧光显微镜，但能扫描不同层次，形成立体图像。 1 共聚焦显微镜发展历史 1955年，Marvin Minsky利用共焦原理搭建了一台共焦显微镜，用来在体观察大脑的神经元网络。 1957年，Marvin Minsky申请了共聚焦显微镜的专利。1970年，第一台单光束共聚焦激光扫描显微镜问世。 1985年，多个实验室的多篇报道显示共聚焦显微镜可以消除焦点模糊，得到清晰的图像。 1987年，BIO-RAD公司推出了第一台商业化的共聚焦显微镜SOM-100。 1987年White和Amos在英国《自然》杂志发表了“共聚焦显微镜时代的到来”一文，标志着CLSM已成为进行科学研究的重要工具。 1 st generation CSLM (1987) 1 个荧光检测通道 扫描频率 50 Hz 2nd generation (commercial systems ca1990) 2-3个荧光检测通道 扫描频率 =100 Hz 3rd generation (1996) 4个荧光检测通道 扫描频率 500 Hz 4th generation (2001) 32个荧光检测通道 扫描频率 2.6 kHz 2 主要的Confocal 制造厂商 Carl Zeiss (physiology, dynamic measurements) Leica (spectral sensitivity) Bio-Rad (multiphoton) Olympus Nikon（水浸物镜） … 成像原理 主要构造 Confocal是将光学显微镜技术、激光扫描技术和计算机图像处理技术结合在的高技术设备。 其主要配置有激光器、扫描头、显微镜和计算机四大部分，包括数据采集、处理、转换及相应的应用软件，图像输出设备及光学装置，光学滤片、分光器、共聚焦针孔及相应的控制系统 显微镜光学系统 显微镜是CLSM的主要组件，它关系到系统的成象质量。 物镜选取大数值孔径平场复消色差物镜，有利于荧光的采集和成象的清晰。物镜组的转换，滤色片组的选取，载物台的移动调节，焦平面的记忆锁定都应由计算机自动控制。 3.1 激光光源 激光又名Laser ，它的全名是 Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation ，受激辐射式光频放大器。 特点－－－ 单色性很好 方向性极好（发散角～10 -4弧度） 光放大 在受激辐射中通过一个光子的作用，得到两个特征完全相同的光子，如果这两个光子再引起其它原子产生受激辐射，就能得到更多的特征完全相同的光子----光放大，激光。 激光的特性 1、单色性好 2、方向性好 3、相干性好 4、能量集中 单色性好－－波长范围很窄 例如氦氖气体激光波长＝632.8 nm 其谱线宽度10－8 nm 激光的特性之------方向性好 由于方向性好，所以在传播很远的距离后仍能保持一定的强度． 由于方向性好，激光可以会聚到很小的一点． 激光的特性之------亮度高 激光还有一个特点是亮度高，也就是说它可以在很小的空间和很短的时间内集中很大的能量． Confocal使用的各种激光器 3.2 扫描和检测装置 Fluorescence, Reflectance or Transmission? 图象采集、转换、计算机控制及输出 LSCM为多通道荧光采集系统，一般有三个荧光通道和一个透射光通道，能升级到四个荧光通道，可对物体进行多谱线激光激发 样品发射荧光的探测器为感光灵敏度高的光电倍增管PMT。PMT前设置针孔，由计算机软件调节针孔大小，光路中设有能自动切换的滤色片组，满足不同测量的需要。 4.2 Confocal图象是以电信号的方式记录下来，所以可以采用各种模拟的或者数字的电子技术进行图象处理。 例如可以显示差异或者变化的图象增强技术、可提高图象分辨率和降低本底的图象修复术以及图象分析技术等。 4.3 共聚焦显微镜在探测器前放置一个pinhole小孔，用来阻止非焦面的信号，同时通过焦面的信号，以消除焦点模糊。 正是因为pinhole小孔的存在，共聚焦系统的景深近似为零，沿Z轴方向的扫描可以实现光学断层扫描，共聚焦显微镜具有了光切能力。 通过累加连续层次的二维图像，经过专门的计算机软件处理，可以获得样品的三维图像。 4.4 和普通荧光显微镜相比 多数共聚焦显微镜所用光源为激光，成像方式为逐点扫描成像，因此又被称为“confocal l