吴松刚--医农两用抗真菌抗生素-灰黄霉素生产关键技术.pptVIP

首届工程研究中心所长会议（2011.12） 与原上海中华制药厂灰黄霉素分厂及江苏南通生化制药厂合作研究(2012.1) 与华侨大学分子药物研究院合作研究(2012.6) 与南京金斯瑞生物科技有限公司合作研究(2013.3) 与台湾宜兰大学合作研究(2013.4) 医农两用抗真菌抗生素—— 灰黄霉素生产关键技术 吴 松 刚 工业微生物发酵技术国家工程研究中心 灰 黄 霉 素 简 介 灰黄霉素（Griseofulvin）作为医农两用的抗真菌抗生素。目前，作为首选药物用于治疗丝状真菌感染，不但如此，其应用范围已扩大到农业、畜牧业及水产等产业。 灰黄霉素生物合成途径 灰黄霉素的生物合成途径可分为两个阶段： ● 多氧甲烯中间体合环以及甲基化和几个氯化步骤成为二苯甲酮。 ● 经过基团氧化偶联形成具有螺环的脱氢灰黄霉素，然后还原成为灰黄霉素。上述生物合成途径中乙酸代谢、氯化作用和甲基化是必不可少。 灰黄霉素生物合成途径 氯化作用是灰黄霉素生物合成途径中的一个关键性反应，cl是灰黄霉素生物合成的前体，cl对生物合成灰黄霉素是必需的，若提供的cl较少或完全不提供cl，灰黄霉素的合成量则大幅度下降甚至不能合成，而转向合成抗真菌活力弱的去氯灰黄霉素。 灰黄霉素生物合成途径 去氯灰黄霉素的超标，不但导至发酵效价偏低，而且造成产品熔点下降，严重影响产品质量。因此，在生物合成灰黄霉素时，必需提供足够量的cl。但要解决高浓度的cl对灰黄霉素生物合成有利，而对菌体的生长不利的这一矛盾，这就决定了采用提高灰黄霉素产生菌高产菌株耐前体—cl的选育技术路线。 采用以灰黄霉素野生型变株4541（从福建厦门莲坂油菜地土壤中分离）作为出发菌株，经过连续二十一代耐前体定向选育，在获得高产白色变株D-756的基础上，经过二次耐前体定向选育，成功地选育出高度耐前体高产变株F-208。 灰黄霉素高产变株F-208选育过程 灰黄霉素高产变株F-208选育过程 灰黄霉素高产变株F-208的获得，使灰黄霉素发酵单位月平均达27000μ/ml以上，发酵全过程中氯离子浓度总量达3.0%以上，产品中去氯灰黄霉素含量在0.2%以下，达到了选育目标。 灰黄霉素高产变株F-208选育过程 ● 具有高发酵单位特性—罐约平均发酵单位达27000μ/ml以 上，单罐最高可达37068μ/ml。 ● 具有耐前体(cl)特性—氯化物浓度高达3.0%以上。 ● 具有高淀粉酶活性—可直接用大米粉或玉米粉作为碳氮源。 ● 具有高糖发酵特性—发酵过程中大米粉或玉米粉可达15% 或18%以上。 ● 具有低PH发酵特性—理想发酵PH为4.8-5.2，明显地降低了 染菌率。 ● 具有耐泡敌特性—发酵过程中泡敌浓度可达0.05-0.07%。 灰黄霉素高产变株F-208发酵特性 灰黄霉素高产变株F-208发酵特性 菌株 碳源 D-756 F-208 相对效价（μ/ml） 出瓶PH 相对效价（（μ/ml） 出瓶PH 乳 糖 100.0 6.4 100.0 6.4 葡萄糖 234.6 7.2 257.5 7.2 蔗 糖 331.4 7.2 344.6 7.2 小麦粉 507.0 7.2 560.0 7.2 玉米粉 573.5 7.2 581.0 7.2 大米粉 796.0 6.7 869.5 6.7 不同碳源对变株F-208发酵单位的影响 灰黄霉素高产变株F-208发酵特性 不同有机氮源对变株F-208发酵单位的影响 菌株 氮源 D-756 F-208 相对效价（μ/ml） 出瓶PH 相对效价（μ/ml） 出瓶PH 不添加 有机氮 100.0 6.9 100.0 7.0 玉米浆 75.5 6.4 82.5 6.7 黄豆粉 106.5 6.7 107.5 7.0 花生饼粉 103.0 6.7 102.5 7.0 酵母粉 103.5 6.8 106.5 7.2 米 糠 109.5 6.4 102.7 6.4 灰黄霉素变株F-208生产工艺控制要点 ● 强化种子工艺控制 ● 提高灰黄霉素变株F-208种子孢子萌发率工艺控制：由萌发率55-60%提高到90-95% ● 稳定灰黄霉素变株F-208大米孢子质量：大米孢子效价45000μ/g干重 ● 优化灰黄霉素变株F-208大米孢子营养液组份及比例 ● 灰黄霉素变株F-208大米