a型流感病毒蛋白与宿主蛋白相互作用分析 word格式.docxVIP

interactedwithNS1inthecytoplasmandmadeafoundationforNS1proteinfunction research in cell cycle regulation and induction of apoptosis.KEYWORDS：InfluenzaAvirus; NS1 protein;HSP70 protein; Interaction目录第一章文献综述11.1流感病毒综述11.1.1流感病毒概述11.1.2流感病毒的复制11.1.3流感病毒的进化方式21.1.4流感病毒常用的检测方法31.1.5流感病毒的结构51.3.3免疫荧光共定位131.3.4免疫共沉淀131.4研究的目的和意义14第二章流感病毒NS1蛋白多抗的制备152.1实验材料152.1.1载体及菌株152.1.2主要试剂152.2试验方法172.2.1pET-NS1 载体的构建172.2.2凝胶回收PCR产物172.2.3pET28 和目的片段双酶切172.2.4柱式回收酶切产物182.2.5构建连接体系182.2.6连接产物转化到大肠杆菌Trans5α182.2.7阳性菌质粒提取182.2.8双酶切验证重组质粒192.2.9将重组质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）192.2.10重组质粒的诱导表达192.2.11纯化目的蛋白192.2.12用抗原免疫小鼠192.2.13ELISA 检测抗体滴度202.3试验结果202.3.1pET-NS1 载体的构建202.3.2重组菌的诱导表达及纯化212.3.3ELISA 检测多抗的效价222.4讨论232.4.1pET-NS1 重组蛋白的表达及纯化232.4.2多抗的制备232.5小结24第三章流感病毒NS1蛋白与HSP70 相互作用的研究253.1细胞和载体253.2主要试剂253.3试验方法273.3.1构建TAP-NS1 载体273.3.2提取转染用质粒27TAP-NS1 质粒转染HEK细胞27Western Blot检测TAP-NS1 蛋白的表达283.3.5G418 筛选HEK细胞稳定表达NS1 蛋白细胞株283.3.6纯化NS1 重组蛋白283.3.7双向电泳303.3.8质谱分析303.3.9GST Pull Down313.3.10免疫荧光共定位323.4试验结果323.4.1TAP-NS1 载体的构建323.4.2真核表达载体TAP-NS1 转染HEK细胞及G418 筛选结果333.4.3G418 筛选HEK细胞稳定表达NS1 蛋白细胞株333.4.4TAP-NS1 蛋白纯化343.4.5双向电泳结果343.4.6GST Pull Down试验结果353.4.7免疫荧光共定位363.5讨论373.5.1双向电泳试验结果373.5.2NS1蛋白与HSP70 蛋白的相互作用383.6小结39第四章结论40参考文献41附录一：主要化学试剂47附录二：主要仪器48发表论文和参加科研情况说明49致谢50第一章文献综述1.1流感病毒综述1.1.1流感病毒概述流感病毒（Influenzavirus）是一种全球范围分布的人畜共患病，全世界每年由于流感发病致死的人数高居所有传染病之首。流感病毒属于正粘病毒科，负链由8 个节段构成，根据其核蛋白（nucleoprotein，NP）和基质蛋白（matrixprotein，MP）的不同分为甲型、乙型和丙型流感病毒，且三种类型的流感病毒均具有较强的感染性[1]。流感病毒不仅对人类具有重大威胁，对其他禽类，家畜也具有高致病性和高致死性[2]。报道显示已经在猪、马、猫、狗、鸡、鸭、鹅、人及海洋生物如海豹、鲸鱼等中发现了流感病毒[3]。在所有的感染宿主中，禽类和鸟类被认为是主要的自然宿主和基因库，目前已报道的所有甲型流感病毒的亚型都能在禽类和鸟类中发现。“混合器”理论认为，禽类、鸟类、人和其他家畜的流感病毒都可以传染给猪，并且猪充当了一个“混合器”的作用，不同型的流感病毒经过猪的传染后常发生基因片段的交换重组而形成新的毒株[4]。甲型流感病毒通常是通过“基因突变”和“基因重排”来进行变异和进化，通过“混合器”以后，流感病毒的毒力、抗原表位等都会发生新的变化。在流感病毒的结构蛋白中，血凝素抗原（HA）是其主要抗原表位，通常新型流感病毒的爆发和蔓延都与HA 蛋白发生变化相关。20 世纪全球共经历了三次影响范围比较广的流感病毒的传染，其中包括：1918 年西班牙流感、1957 年亚洲流感和1968 年香港流感[3]。进入21世纪以来最著名的就是2009年全球爆发的H1N1甲型流感病毒。2009年甲型流感病毒首先在美国爆发后迅速延伸到墨西哥等地，并在短短几个月内席卷全球，扰乱了全世界的正常秩序，并对全球造成了巨大的经济损失和人员伤亡。2