聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质Separatingserumby.PPT

实验目的 实验原理 试剂、仪器 实验步骤 实验结果与分析 注意事项 实验目的 1.掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳分离混合蛋白质的原理。 2.熟悉聚丙烯酰胺凝胶电泳的实验方法和操作技术。 实验原理 实验原理 实验原理 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种电泳方法。凝胶是聚丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺交联而成的，催化剂为过硫酸铵，加速剂为TEMED。 实验原理 电荷效应 （电泳物所带电荷的差异性） 分子筛效应（凝胶的网状结构及电泳物的大小形状不同 所致） 浓 缩 效 应 浓缩效应 实验仪器、试剂 1．垂直板电泳糟 2．直流稳压电源 3．微量注射器 4．电泳仪 实验步骤 3.配置血清样品及加样 将样品梳拔出，用电极级冲液冲洗样品孔。样品与样品缓冲液按一定比例混合好（蛋白含量大约为1-2μg/μl）。用微量注射器加入加样孔，加样量为5-10μl。 4.电泳及染色、脱色 电泳：连接直流稳压电源，矮板连负极，打开电源开关。调节电流，进入分离胶之前为100v，进入分离胶之后为120v。 染色: 关闭电源，取下凝胶模。在脱色摇床上用考马斯亮兰染色1h。 脱色：将胶取出，蒸馏水冲洗数次后，放入脱色液中，数小时换液一次，直至背景清晰为止。 实验结果 注意事项 勿用手碰凝胶 勿使胶液产生气泡 凝胶聚合后勿倒入水池 电极缓冲液回收 * * 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质 (Separating serum by polyacrylamide gel electrophoresis) 带电颗粒在电场作用下向着与其电性相反的电极移动的现象，称为电泳。 带正电荷的粒子向负极移动，带负电荷的粒子向正极移动。 是生化与分子生物学的重要研究方法之一，可用于样品分离、物质纯度分析和分子量的测定等。 在一定pH条件下，每一种分子都具有特定的电荷（种类和数量）、大小和形状，在一定时间内它们在相同电场中泳动速度不同，各自集中到特定的位置上而形成紧密的泳动带。这就是带电粒子可以用电泳技术进行分离、分析和鉴定的基本原理。 + - 凝胶的不连续性 缓冲离子的不连续性 pH的不连续性 电位梯度的不连续性 分离胶 pH8.9 浓缩胶 pH6.7 ① 凝胶的不连续性： 浓缩胶：大孔径。样品在其中浓缩，并按迁移率递 减的顺序逐渐在其与分离胶的界面上积聚 成薄层。 分离胶：小孔径。蛋白质分子在大孔胶中受到的阻 力小，移动速度快，进入小孔胶时遇到的 阻力大，迁移速度减慢。由于凝胶的不连 续性，在大孔胶和小孔胶界面处就会使样 品浓缩，区带变窄。 ② 缓冲离子的不连续性 ③ pH的不连续性 ④ 电位梯度的不连续性 制胶缓冲液：Tris-HCl 浓缩胶：pH6.7 分离胶：pH8.9 电泳缓冲液：Tris-甘氨酸 在浓缩胶中，pH环境呈弱酸性，甘氨酸解离少，在电场作用下泳动效率低，而Cl—却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子介于二者之间泳动。 浓缩效应 由于导电性与电场强度成反比，这一区带形成了较高的电压梯度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。 样品进入分离胶（pH8.9）后，由于胶中pH的增加，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随Cl-之后，样品不再受离子界面的影响。 浓缩效应 实 验 流 程 制板 制备分离胶 制备浓缩胶 加样 电泳及结果检测 染色和脱色 1、安装夹心式垂直板电泳槽： 主要注意：安装前，胶条、玻璃板都要洁净干燥；勿用手接触灌胶面的玻璃。 2、制备凝胶板 （1）分离胶制备（10%分离胶，20ml/电泳槽） （2）浓缩胶的制备（5%浓缩胶，10ml/电泳槽） 凝胶配方 浓缩胶5% 分离胶10% 丙烯酰胺储存液ml 1.5 8.4 浓缩胶缓冲液 3.75 —— 分离胶缓冲液 —— 12.5 双蒸水 —— 0.75 2.5%过硫酸铵 0.4 0.5 TEMED 1.0 1.5 *