荧光定量PCR技术讲座：理论基础、引物及探针设计、体系优化、实 验方案.ppt

二、引物及Taqman探针的设计 2、Taqman探针及引物的设计原则： 探针中GC含量的差异对定量PCR反应效率的影响 * 二、引物及Taqman探针的设计 3、Taqman探针及引物的设计举例 1 ATGAACTACG TTGGACAGTT AGCAGGGCAA GTGTTTGTAA CTGTGAAGGA GCTCTATAAG 61 GGACTAAACC CAGCCACGCT GTCGGGATGT ATCGATATAA TTGTTGTACG TCAGCCAGAT 121 GGGAATCTTC AGTGTTCTCC ATTCCATGTA CGCTTTGGGA AAATGGGAGT TCTGCGTTCC 181 AGGGAGAAAG TGGTTGACAT AGAAATTAAT GGAGAGGCTG TAGATTTGCA CATGAAGCTA 241 GGAGACAATG GAGAAGCCTT TTTCGTCCAG GAGATGGATA ACAATCAGGA GGTAATTCCT 301 TATCATCTGT CTACGTCCCC CATCCTGTCT GAGGGAACTG CGTTAATGGA AGCTCAGCTG 361 AAGAGAAACT CAATTGACAG GATAAGAAAC CTGGACAGCA GTGTATCTTC ACAAGTACCA 421 CCCCAAGCTC ATGGATCCCA GCCTGGTACT GAAACATCTC CAGCCTGTAG CTCTGTGAAA 481 AAGAGGAGGA AAAAGAGGAG GAAGTCTACC CACAAAATAG ACAGCTTAAA AAGAGAAGAC 541 ATTGGAGATA CATCAGAAGA TGAAGACATG TTTCCTATAG AGATTAGCTC AGAGGAAGAA 601 AAGGAACAAT TGGACAATTC AAGGATTCTT GTTCCAGATG TGTTTGTTGA TGAAGTATCT 661 GATATAAAGG CTCCTGCTGT TTCTGCTTAT TCTCAGTCTT CATCTTACCC TCGTTCGGAT 721 GGAGAATGGT CACCCATTCA AAGTAAGCCC ATAGATTACA CAGGGCAATC CTCTCTTCTC 经Oligo软件验证，探针TM值70℃左右，上下游引物的TM值都为60 ℃左右，二级结构 分析，引物和探针比较理想，再经BLAST分析，引物和探针特异性较好。 * 二、引物及Taqman探针的设计 4、Taqman探针及引物合成时注意事项 （1）、引物及探针设计好之后，委托一家放心的合成公司合成； （2）、先不要急于合成探针，先引物合成，引物合成好以后，做普通 PCR，电泳检测PCR产物，看是否和设计的长度吻合，再看看非特异 性扩增情况，必要时进行PCR产物的测序验证； （3）、确定引物没有问题后，再将探针送交合成，这样安排能避免很多以 外的损失； （4）、探针合成好后，先检测一下探针的质量，250nm的探针终浓度， 25ul水，反应体系中只有水和探针，在荧光定量PCR仪上检测， 95℃，2min; 95℃，20s，60℃，20s，40个cycles；看荧光本底和 荧光强度的变化情况，好的探针荧光本底较低，随着PCR反应，荧 光强度不会变化，假如荧光强度变化的比较大，说明探针合成质量 较差，建议重新合成。 * 三、内参基因的选择 1、理想的内参基因具有的特点 （1）、不存在假基因； （2）、高度或中度表达，排除太高或低表达 （3）、稳定表达于不同类型的细胞和组织(如正常细胞和癌细胞)，而且其 表达量是近似的，无显著性差别； （4）、表达水平与细胞周期以及细胞是否活化无关； （5）、其稳定的表达水平与目标基因相似； （6）、不受任何内源性或外源性因素的影响，如不受任何实验处理措施的 影响。 理想的内参基因很少或者说不存在，因为所有基因在不同的细胞或组 织中、在细胞的不同生理时期、在不同的理化等外界刺激下，其表达量都 会有所差异，有时可以是几倍、几十倍甚至是上百倍的差异。盲目地使用 一种看家基因作为内参，一方面可能使基因表达的微小差异难以发现，另 一方面可能引致错误甚至相反的结论。 * 三、内参基因的选择 2、常用内参基因的表达情况 （1）、GAPDH GAPDH mRNA在不同癌组织(包括肺癌、乳腺癌、肾细胞癌等)中的