柑橘or基因功能初步探索与质体基因组基因表达分析-果树学专业论文 word格式.docx

柑橘OR基凶功能初步探索与质体基凶组基凶表达分析目录Ej录．I摘要．iAbstract．．．iv缩略语表(Abbreviations)viii1．前言一11．1．课题的提出．11．2．前人研究进展一31．2．1．类胡萝卜素与柑橘色泽31．2．2．柑橘各类色泽突变体的发现与代谢机理研究51．2．3．类胡萝卜素与质体发育61．2．4．花椰菜色泽突变体的发现与Or基因功能研究．71．2．5．其他物种中Or基冈功能的研究．91．3．本研究的目的与主要内容102．材料与方法112．1．实验材料1l2．1．1．柑橘果肉材料．112．1．2．柑橘胚性愈伤组织材料．122．1．3．拟南芥野生型与转Or基冈型种子132．1．4．载体和感受态细胞．132．1．5．实验仪器、试剂与耗材．142．2．实验方法152．2．1．柑橘胚性愈伤组织DNA提取152．2．2．柑橘RNA提取152．2．2．1．柑橘果肉RNA的粗提与纯化(异硫氰酸胍法)152．2．2．2．柑橘胚性愈伤组织RNA提取162．2．3．柑橘RNA的反转录(聊(aRa试剂盒)一162．2．4．实时定量荧光PCR(qRTPCR)一172．2．4．1．同源序列分析与qRTPCR引物的设计、检测172．2．4．2．qRTPCR ．．．．．．．．．．．．．．．．172．2．5．柑橘Or基因超量表达载体构建172．2．5．1．PCR重组克隆与片段回收．172．2．5．2．BP重组反应．18万方数据华rfl农业大学2015届硕士研究生学位(毕业)论文2．2．5．3．热激转化大肠杆菌感受态菌株(E．coilDH5a)．182．2．5．4．大肠杆菌感受态菌株(E∞玎DH50【)阳性克隆的验证及测序．192．2．5．5．测序结果的核对与质粒的提取．192．2．5．6．LR重组反应与终载体的构建192．2．6．根癌农杆菌侵染菌株的制备与柑橘胚性愈伤组织的遗传转化．202．2．6．1．热激转化根癌农杆菌感受态菌株(ehal05)一202．2．6．2．根癌农杆菌感受态菌株(ehal05)阳性克隆的验证与菌液保存一202．2．6．3．柑橘胚性愈伤组织的准各一2l2．2．6．4．农杆菌侵染液的制备．2l2．2．6．5．侵染、共培养及筛选培养．2l2．2．7．抗性愈伤组织后期筛选与阳性鉴定．212．2．8．细胞学分析．232．2．8．1．柑橘胚性愈伤组织原生质体分离与观察分析．232．2．8．2．柑橘转Or基因抗性愈伤组织单系的饥饿处理与TEM观察．242．2．8．3．拟南芥种子的愈伤诱导与TEM观察242．2．874．珀溪蜜枘色泽突变体果肉汁胞TEM观察243．结果与分析253．1．珀溪蜜柚色泽突变体成熟果肉汁胞有色体电镜分析253．2．拟南芥野生型与转Or基因型种子的愈伤诱导与电镜分析．263．3．柑橘各类色泽突变体中Or基冈与质体基冈组基冈的表达分析．283．3．1．柑橘Or基冈的确定283．3．2．柑橘各类色泽突变体的RNA提取与反转录293．3．3．qRTPCR引物质量检测．303．3．4．柑橘各类色泽突变体中Or基冈表达分析(数据详见附录V)3l3．3．4．1．珀溪蜜枘色泽突变体成熟果肉中Or基冈表达分析313．3．4．2．暗柳橙与红暗柳橙发育时期果肉中Or基冈表达分析323．3．5．柑橘质体基因组基因表达分析(数据详见附录V)．343．3．5．1．璃溪蜜柚色泽突变体成熟果肉细胞质体基因组基因表达分析．343．3．5．2．暗柳橙与红暗柳橙发育时期果肉细胞质体基冈组基因表达分析．373．4．柑橘Or基冈遗传转化。403．4．1．柑橘Or基因的克隆与超量表达载体的构建403．4．2．柑橘Or基因超量表达载体的农杆菌转化423．4．3．柑橘转Or基因抗性愈伤组织的获得423．4．4．柑橘转Or基冈抗性愈伤组织单系的挑选与培养44II万方数据柑橘OR基凶功能初步探索与质体基凼组基凶表达分析3．4．5．柑橘转Or基冈抗性愈伤组织单系的鉴定与分析463．4．5．1．柑橘转Or基因抗性愈伤组织单系的阳性鉴定463．4．5．2．柑橘转Or基因抗性愈伤组织单系的RNA提取与反转录．463．4．5．3．柑橘转Or基因抗性愈伤组织单系相关基因表达分析(数据见附录V) ．473．4．5．4．柑橘转Or基因抗性愈伤组织单系的细胞学观察494．讨论554．1．柑橘各类色泽突变体中色泽表型、Or基冈表达量及有色体数量三者之问的关系554．2．柑橘质体基因组基因表达的规律性、多样性与特异性探讨564．3．柑橘遗传转化超量表达载体的构建方法比较574．4．柑橘转伽基冈cs7918870抗性愈伤组织单系呈色原冈分析．574．5．柑橘伽基冈Cs7918870亚细胞定位探讨584．6．抗性愈伤组织单系细胞内质体发育状况与Or基冈功能浅析．58