实验五 PCR扩增.ppt

实验四 PCR扩增技术 能在一个试管内将所要研究微量的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断。 PCR使人们能通过试管内的数小时的反应将特定的DNA片段扩增数百万倍。该技术已成为分子生物学研究的重要技术体系，其建立极大地推动了生命科学的研究进展。在DNA重组与表达、基因结构分析与功能检测具有重要的应用价值。 1. PCR的基本原理 PCR的原理是根据待测DNA片段两端的核苷酸序列，设计并人工合成两个分别与DNA片段两端互补的寡聚核苷酸引物，在有过量的引物、过量的底物（4种dNTP）、DNA聚合酶以及模板的反应体系中，经过高温变性、低温退火和适温延伸三个阶段的循环周期，对DNA分子进行扩增。 由于新合成的DNA双链能够作为下一循环的模板，所以模板DNA以几何级扩增。一般经过30-35次扩增循环，可使目的基因DNA片段放大数百万倍。 2. PCR体系的主要成分 （1）模板 单、双链DNA均可。 不能混有蛋白酶，特别是染色体中的组蛋白、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。 一般100ng DNA模板/100?L。 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。 （2）引物浓度 0.1-0.5 ?mol/L 浓度过高易导致模板与引物错配, 反应非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。 （3）Taq DNA聚合酶 0.5-2.5 U/50 ?l 酶量过高可引起反应非特异性扩增;酶量过少则合成产物量减少。 （4）dNTP浓度 取决于扩增片段的长度 四种dNTP浓度应相等，如果有一种浓度不同于其他几种，就会引起错配。 浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量 dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性。 （5） Mg2+浓度 Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。 0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。 Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg2+过高反应特异性降低，出现非特异扩增。Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。 3. How PCR works Three steps: Denaturation (变性): 将反应体系加热至90-97℃，使模板DNA完全变性成为单链，同时引物自身以及引物之间存在的局部双链也得以消除。 Annealing (退火): 当温度突然降低至45-65℃,引物与其互补的单链DNA模板在局部形成杂交链。 Extension (延伸): 将温度升高至70-74℃下，在Taq DNA 聚合酶和四种脱氧核糖核苷三磷酸底物及Mg2+存在的条件下引物沿着模板DNA延伸。 利用PCR仪来控制温度 一、实验目的 掌握PCR扩增技术。 二、 实验原理 三、实验步骤 1、引物设计与合成 根据GenBank上发表的猪的UCP3基因（Uncoupling protein 3）第五内含子序列，设计引物，预期产物大小为463bp，引物序列为： 上游引物：5’GGTCAAAGTGCCATCAGC3’ 下游引物：5’AAGGGTAGGAAGCGGTAGA 3’ 2、PCR扩增 ① 引物的稀释 将引物短暂离心后，进行稀释，保存于-20℃（引物贮存浓度为100μmol/l，使用浓度为10μmol/l）。 ② PCR扩增反应体系 采用20μl的反应体系 DNA模板template 1μl Primer 1（10μmol/l） 0.5μl Primer 2（10μmol/l） 0.5 μl rTaq 10 μl 超纯水 补至20μl（8μl） ③ PCR扩增条件 3、结果检测 琼脂糖凝胶电泳检测，取5μl产物，加样于2%琼脂糖凝胶，点6μl 100bpMarker。 100V电泳 30min。特异性很好的产物才能用于PCR-SSCP检测。产物放置于-20度保存。 4、注意事项 PCR反应在一个没有DNA污染的干净环境中进行。 所有试剂都应没有核酸和核酸酶的污染，操作过程中应戴手套。 * * 聚合酶链反应( Polymerase Cha