4第四章节 目的基因的制备2.pptVIP

第四章 目的基因的制备;三、cDNA基因文库的构建及目的基因的分离;表达型：必须采用表达载体(如λgt11) 。插入片段可表达融合蛋白，有活性、抗原性。常采用能与表达产物发生特异性结合的抗体或化合物进行标记筛选。特别适用于氨基酸序列不清楚的蛋白质的筛选 。 非表达型：可用一般载体(如λgt10) ，适用于已知氨基酸顺序或其同源序列蛋白质，根据氨基酸密码子，人工合成寡核苷酸作为探针进行筛选。 ;cDNA文库按所用载体分: 质粒cDNA文库(含克隆数少，适于高丰度mRNA) 噬菌体cDNA文库(含克隆数多，适于低或极低丰度mRNA); 分离细胞总RNA，并从中分离纯化出mRNA （含oligo（dT）的纤维素柱） 以mRNA 为模板，合成cDNA 第一链 双链cDNA 的合成 常用方法:第一 第二 第三 第四 第五 将合成的双链DNA重组入载体，导入宿主(大肠杆菌)增殖;要获得高丰度的某mRNA, 必须选好适当的材料. c DNA基因文库大小理论公式 cDNA的克隆数 =细胞总mRNA数/细胞中某种mRNA的拷贝数 实际需构建的最小值远超过公式理论值 经验公式： N=ln( 1-P ) / ln( 1-f ) N： c DNA基因文库必需的克隆数 P：文库中含目的基因c DNA片段的出现概率 f：某mRNA 的丰度