青岛农业大学-分子生物学实验考试.docVIP

实验一、大肠杆菌感受态细胞的制备与质粒DNA的转化 实验目的 1、掌握大肠杆菌感受态细胞的制备方法 2、解转化的概念及其在分子生物学研究中的意义学习将外源质粒 DNA 转入受体菌细胞并筛选转化体的方法 重组DNA分子体外构建完成后，必须导入特定的宿主（受体）细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化。 在原核生物中，转化是一个较普遍的现象，在细胞间转化是否发生，一方面取决于供体菌与受体菌两者在进化过程中的亲缘关系，另一方面还与受体菌是否处于一种感受状态有着很大的关系。 所谓的感受态，即指受体（或者宿主）最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态，它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。cAMP可以使感受态水平提高一万倍，而Ca2+也可大大促进转化的作用。细胞的感受态一般出现在对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。 制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油或-70℃保存（有效期6个月）。 2、 转化的概念及原理 在基因克隆技术中，转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。 受体细胞经过一些特殊方法，如电击法、CaCl2等化学试剂法处理后，使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。 用CaCl2处理大肠杆菌细胞使其处于感受态后，通过热激处理可将质粒转化进入细菌中。进入细菌细胞的质粒能够自主复制并在宿主中实现其携带基因的转录、表达。本实验使用的pUC19质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Amp )，理论上只有转入了pUC19质粒的大肠杆菌才能在含Amp的培养基上生长。但抗性筛选只是初步的筛选，可能仍有部分未转进质粒的细菌能在抗性培养基上生存（假阳性），因此尚需提取质粒酶切、电泳作进一步的鉴定。 三、 实验材料、设备及试剂 1、实验材料 大肠杆菌单菌落液体培养物 2、实验设备及器具 低速冷冻离心机、超净工作台、50 ml 离心管、10 ml刻度移液管、玻璃棒（三种器具均已经过灭菌处理）。恒温水浴箱 恒温摇床 无菌离心管 标记笔 玻璃涂布器 微量移液器 3、试剂及配置0.1 M氯化钙溶液（配制：称取1.1g无水氯化钙，溶于90ml双蒸水中，定容至100 ml,试剂瓶中℃灭菌20 min，保存。LB培养基 蛋白胨(typtone)　　　　　　　　　 1.0% 酵母提取物(Yeast extraction)　　 0.5% 氯化钠　　　　　　　　　　　　1.0% （1 g/100 ml） PH 7.0　Amp）50mg/l的固体LB培养基 LB液体培养基中加1.5%琼脂粉，高压灭菌消毒，待泠却至不烫手时加入Amp铺培养皿。 pUC19质粒 配制成约50ng/μl。 四、 实验步骤 操作步骤 感受态细胞的制备(0.1M CaCl2方法) 从LB固体平板挑单克隆于5ml LB液体培养基中(不加抗生素)，37℃×200rpm×12-16h，可过夜培养。 将活化菌体按1`～5％接种到LB中，扩大培养37℃×200rpm×2h，至OD600约为0.4。 取培养好的菌液1.5 ml于一离心管中，4℃ 离心8 000rpm×1 min。 弃上清，加500 ul 0.1M CaCl2 (灭菌预冷)洗菌体，4℃冷冻离心8000rpm×1 min。 彻底除去残液, 加200 ul 0.1M CaCl2 (灭菌预冷)，悬浮菌体。 冰浴静置 30 min ，4℃冷冻离心8000rpm×1 min。 弃上清，加100 ul 0.1M CaCl2 (灭菌预冷)，悬浮菌体，即为制备好的感受态细胞。 附注： 整个过程注意无菌操作和保持低温。 培养物处于对数生长期是制备感受态细胞的关键。 如果要求高转化效率，不建议使用简单深冻保存的感受态细胞。 LB液体培养基建议用不加抗生素和加抗生素的两种培养基，检查菌体是否污染。 D600值指细胞密度，用于判断培养物是否处于对数生长期。OD600值在0.4 - 0.5时，此时培养物处于对数生长期，细胞数在20min内加倍。 二、质粒对大肠杆菌的转化 1、将连接产物加入100 ul制备好的感受态细胞，冰上放置30 min。 2、42℃热激90S。 3、迅速冰浴3min。 4、加入300 ul LB液体培养基，37℃轻摇培养45min。 5、加入30 ul X-gal和6 ul IPTG,混匀。 6、取100 ul涂布在含