基因的序列分析与研讨 20131024.pptVIP

分子生物学硕士理论课教学安排：;基因序列分析的基本策略;基因的序列组成分析（一级结构）;1. DNA序列测定;1. DNA序列测定（DNA sequencing）;（1）Sanger双脱氧末端终止法;（1）Sanger双脱氧末端终止法;（1）Sanger双脱氧末端终止法;（1）Sanger双脱氧末端终止法;MOVIE; ;缺点：;（2）全自动激光荧光DNA测序;荧光标记四种ddNTP，只需做一个反应。; ; ;（3）焦磷酸测序法;（3）焦磷酸测序法;（3）焦磷酸测序法;（3）焦磷酸测序法;第一步：加入测序引物，相关酶，底物，和其他试剂;（3）焦磷酸测序法;（3）焦磷酸测序法;（3）焦磷酸测序法;（3）焦磷酸测序法;（3）焦磷酸测序法;1. EFGR过表达于大量的肿瘤组织，在肿瘤的生长，分化种起着重要的作用。;K-ras基因突变致使细胞内KRAS蛋白持续活跃从而导致抗EGFR的抗体耐药;KRAS基因突变主要发生在密码子12，13上;密码子12/13发生变异的患者; 应用;5’甲基胞嘧啶 在亚硫酸盐的作用下变成胸腺嘧啶;1. DNA序列测定;2. 限制性片段长度多态性分析 (Restriction fragment length polymorphism ,RFLP) ;RFLP原理：;RFLP应用举例;1. DNA序列测定;3. 核酸分子杂交（Nucleic acid hybridization）;根据分子杂交的原理，利用一条已知的核酸序列，用这条核酸量可以检测出有没有与其互补的碱基序列。 被标记上可检测信号的、已知序列的单链核酸片段 (RNA或DNA ;探针的标记; 随机引物法; 将已知序列的核酸片段 (单链RNA或DNA)进行标记,使之带有特殊可检测信号，作为探针，与未知DNA或RNA单链进行分子杂交,检测未知DNA或RNA单链中，是否存在与探针序列互补的特定序列。;探针技术;利用核酸探针检测DNA的核酸杂交称作Southern 印迹杂交;Southern 印迹杂交;Southern 印迹杂交;; ; ; ; ;Southern印迹的应用; ; ;;斑点杂交（Dot Blot） ;荧光原位分子杂交 （FISH, Fluorescence In Situ Hybridization ） ;DNA芯片技术 (Gene chip) ;;DNA芯片的应用 ;基因的序列组成分析 （一级结构）;RT-PCR分析;1. Northern 印迹 (Northern blot);2. RT-PCR技术;PCR的原理?; 特异性的扩增了DNA片段 DNA片段以2n（ｎ为反应周期数）的倍数增加。;RT-PCR的原理?;RT-PCR可相对定量分析特定mRNA;组成性表达 多拷贝基因，mRNA量丰富 可能存在假基因;3. 荧光实时定量PCR技术; 原理;TaqMan 探针法;;2. 退火: 无荧光信号;3. 延伸: DNA聚合酶切下5’端荧光素，出现荧光; ;3. 荧光实时定量PCR技术;结果分析;; 定量原理:利用已知的梯度浓度的标准样品作出标准曲线。通过未知样品的Ct值,从标准曲线上计算出该样品的起始浓度。 ;实时PCR的特点：;基因的序列组成分析 （一级结构）;焦磷酸测序分析基因突变，SNP的方法！ 实时PCR、基因芯片是定量分析基因的最好方