第二章节 遗传的物质基础DNA2.pptVIP

第二章 　遗传的物质基础;一．遗传物质的发现;二．　核酸的结构及理化特性;DNA的一级结构中，有一些碱基可以通过加上一个甲基而被修饰，称为DNA的甲基化(mythylation of DNA)。 1）原核生物（细菌）有限制一修饰系统 ①对自身DNA产生保护作用。 ②抵御外源DNA（噬菌体）的入侵。 2）真核生物中的DNA甲基化在基因表达调控中有重要作用;Nucleic Acid Structure;核酸的理化性质;（一）核酸扩增、杂交;核酸分子杂交的基本原理;变性;DNA变性与复性;（2）变性的方法： a. 热变性：温度升高到90~100℃时，双链核酸 分子链间的氢键完全断裂。 b. 酸碱变性：pH值低于3或高于10时，双链核 酸分子链 间的氢键断裂。 c. 化学试剂变性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使 双链核酸分子链间的氢键断裂。;(3) 变性后的理化性质变化： 粘度降低 密度增加 紫外吸收值增加;(4)DNA变性曲线 AT区先解链 GC区后解链 阶梯式曲线 ;(5) GC含量与Tm值之间的关系 （G+C）%=（Tm-69.3) ×2.44 Tm =(G+C)%×0.41+69.3 ;2、复性 （1）定义：变性的单链核酸分子在一定条件下按碱基互补原则重新结合为双链核酸的过程，称复性或杂交。 具有互补序列的两条单链核酸都可互补形成双链： DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA、寡核苷酸/DNA和寡核苷酸/RNA。;;3、核酸变性后的复性速度取决于核酸分子的复杂性： （1）核酸的复杂性是指存在于反应体系中不同顺序的总长度 （2）Cot?与反应体系中核酸复杂性成正比 （3）两个DNA样品浓度绝对一致时，变性后的相对杂交率取决于DNA的相对复杂性 ;Southern印迹杂交 1、待测核酸样品的制备 （1）裂解或破碎细胞 （2）抽取纯化基因组DNA （3）限制酶消化DNA为大小不同的DNA片段;2、待测DNA样品的电泳分离 （1）琼脂糖浓度：分离大片段用低浓度胶 分离小片段用高浓度胶 （2）凝胶电泳：凝胶具有分子筛效应，大分子 DNA泳动慢,小分子DNA泳动快， 大小 相同的分子处于同一条带 （3）分子量标准：经HindⅢ消化的λDNA，杂交所用分子量标准可用核素标记 ;3、凝胶中核酸的变性（碱变性） 凝胶置于NaOH溶液中使DNA变性断裂为较短的 单链 DNA,中性缓冲液中和凝胶中的缓冲液 ;4、Southern印迹;;（a）; 5、Southern杂交 （1）预杂交：封闭膜上能与DNA结合的位点 预杂交液为不含DNA探针的杂交液 （2）杂交：液相中的DNA探针与膜上的待测DNA杂交双链DNA探针需加热变性为单链，再杂交 （3）洗膜：去除游离的放射性探针或非特异结合的DNA ; 6、杂交结果检测 （1）放射自显影：适用于放射性核素标记的探针 （2）比色或化学发光检测：适于非核素标记的探针;Southern DNA 印迹杂交之X光显像图片 水稻（Oryza sativa L.)的叶绿体DNA分别用核酸内切限制酶BglⅡ(A-C)、BamHⅠ（D-F）、EcoRⅠ（G-I）、和HindⅢ（J-L）消化，加样在含有EtBr染料的1%的琼脂糖凝胶电泳中作电泳分离，然后同32P标记的玉米psbA探针作Southern杂交。X光底片中显现的阳性条带 ，表明含有水稻的psbA基因序列。;Southern杂交分析示例;;Northern印迹与Southern 印迹的不同点 1、变性：RNA电泳前加热变性、电泳时加变性剂保 持RNA处于变性状态，DNA电泳前和电泳 中不变性 2、转膜：RNA转膜