基于质谱的蛋白质相互作用研究方法靶蛋白制备.PPT

有机荧光团染料 包括共价结合和非共价结合的荧光团染料两类，后者最为常用，其典型代表是已经商品化的SYPRO Red、 Orange、 Ruby等荧光染料 可对SDS胶内蛋白质进行一步染色，约30~60min完成 灵敏度为2~10ng其线性范围为3个数量级 在Tris/甘氨酸转印缓冲液中染色后，蛋白质可被转印至膜上并进行免疫染色或Edman测序来鉴定蛋白质 金属螯合染料 与现代蛋白质组学研究相兼容的 专门与常用微量化学表征过程兼容 不包含戊二醛、甲醛或Tween-20等，很容易和集成化蛋白质组学平台（包括自动化凝胶染色仪、图像分析工作站、机器人剪切仪器、蛋白质酶解工作站和质谱仪等）相结合 染色方法 凝胶的图像处理分析 典型流程 凝胶图像的扫描 图像加工 斑点检测和定量 凝胶配比 数据分析 数据呈递和解释 2-DE数据库的建立 2-DE 分离的可溶性 E. coli 蛋白 目前双向电泳需解决的问题 样品的制备及溶解 不溶性蛋白(膜蛋白及核内蛋白) 难分离蛋白(如毛发及皮肤中的蛋白) 载样量的提高 初步分离 低丰度蛋白、碱性蛋白及大分子量蛋白 定量分析 灵敏度及可重复性 对于双向电泳的建议 首先采用宽pH范围的胶条，确定蛋白的分布范围，通常采用pH3-10的胶条 如果pH线性分布的胶条分离效果不好，可采用非线性胶条 加大蛋白上样量，提高局部蛋白的分辨率 采用窄pH范围的胶条，提高某pH范围蛋白的分辨率 第二向采用梯度胶进行分离 去除高丰度蛋白，进行蛋白的分级处理，富集低丰度蛋白 蛋白质质谱技术 质谱基础 样品 离子源 质量分析器 离子检测器 固体 液体 蒸汽 形成离子 (带电分子) 电离 质量分选(过滤) 检测 根据m/z分选离子 数据处理 质谱 检测离子 基本步骤: 1. 样品离子化 2. 根据质量(m/z)不同分离离子 3. 检测每种质量离子的数目 4. 收集、处理数据得到质谱图 质谱的评价指标 质量范围 速度 灵敏度 分辨率 精确度 + + + 自由漂移区 检测器 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS) 样品探针 激光 335 nm m/z 相对强度 MH+ MH+ MH+ 特点： 灵敏度高 准确度高 分辨率高 质量范围广 图谱简明 速度快 ESI 四级杆质量分析器 碰撞室 反射器 MCP 检测器 碰撞气体 串联质谱法 (MS/MS) ESI-Q-TOF 质谱仪 步骤： 1质量分析 2碰撞(离子裂解) 3质量分析 TOF质量分析器 强的抗背景干扰能力 极高的检测灵敏度和准确度 可用来分析复杂混合物中的蛋白质 丰富的检测信息，高通量鉴别蛋白质 串联质谱的优点 1、鉴定和注释蛋白质的路线 通过肽质谱指纹图（peptide mass fingerprinting，PMF）和数据库搜寻匹配 通过串联质谱进行单个或多个蛋白质的鉴定 鸟枪法蛋白质组学 1234.5396 783.9147 375.2561 多肽 已测得质 谱数据或理论 质谱 数据 MALDI-TOF检测的多肽指纹 胰酶消化 凝胶 蛋白质 数据库 ? 1 2 3 比较: ?? 是否相同 ?? 质谱 3235.2256 肽质谱指纹图在数据库中匹配不成功的可能原因 样品量太少，PMF图信噪比太低，输入库中搜寻的数据质量不好。 2-DE胶上所取的一个蛋白质点并非单一蛋白质，所获PMF图实际上是两个以上蛋白质的混合图。 操作中角蛋白或其他蛋白质的污染 蛋白质发生了较多的转译后修饰，数据库中未有记载 所用胰蛋白酶质量不够好，蛋白酶自酶解片段多 未知的新蛋白质 数据库规模太小 续： 氨基酸序列 VLDPNTVFAL 蛋白质数据库 ？查询 串联质谱图 从头测序 输入 输出 序列片段 PNT ① ② ③ 串联质谱鉴定多肽的计量方法 组织切片或印片原位质谱分析技术 两级飞行时间串联质谱（MALDI-TOF/TOF） 傅里叶转换回旋共振质谱（FTMS） 表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱（SELDI-TOF-MS） 联合技术精确鉴定蛋白质 2、基于生物质谱的定量蛋白质组研究策略 原理：对于具有相同离子化能力的蛋白质或多肽，可以通过比较质谱峰的强度（或峰面积）得到待比较蛋白质的相对量。 3、基于质谱的蛋白质相互作用研究方法 靶蛋白制备 蛋白质复合体的纯化 蛋白质复合体的质谱鉴定 基本步骤： (1)亲和层析耦联质谱技术 基本原理：将某种蛋白质以共价键固定在基质（如琼脂糖）上，含有与之相互作用的蛋白质的细胞裂解液过柱，先用低盐溶液洗脱下未结合的蛋白质，然后用高盐溶液或SDS溶液洗脱结合在柱子上的蛋白质，最后用多维液相色谱耦联质谱技术（MDLC-ESI-MS/MS）鉴