聚合酶链式反应-2011 分子生物学精品.ppt

实时PCR技术原理 Q R 3 3 5 5 上游引物 下游引物 荧光标记分子 R Q 3 3 5 5 荧光报告分子 荧光淬灭分子 荧光信号 SYBR Green I作用机理 Emission Emission SYBR Green I作用机理 Excitation Emission 原位PCR(In Situ PCR,IS-PCR)是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内进行原位扩增目的片段,在不破坏细胞的前提下,利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物进行定性定量定位分析。 即把原位杂交的细胞定位技术与PCR的高灵敏度相结合的技术。 三、原位 PCR ▲ 待检标本先经化学固定，以保持组织细胞的良好形态结构。细胞膜和核膜均具有一定的通透性，PCR扩增时，各种成分，如引物，DNA聚合酶，dNTP等均可进入细胞内或细胞核内。 ▲ 以固定在细胞内或细胞核内的RNA或DNA为模板，于原位进行扩增。扩增的产物一般分子较大，或互相交织，不易穿过细胞膜或在膜内外弥散，被保留在原位。使原有的细胞内单拷贝或低拷贝的特定DNA或RNA序列在原位以呈指数扩增，扩增的产物就很容易被原位杂交技术检查。 ▲ 使用专用原位PCR的仪器。 用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。 对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆,扩增基因文库的插入DNA； 已知序列 未知序列 未知序列 四、反向 PCR 已知序列 未知序列 未知序列 限制酶 限制酶 连接酶 未知序列 已知序列 不对称PCR 用不等量的一对引物扩增后产生大量的单链DNA（ss-DNA） 。 这对引物分别称为非限制引物与限制性引物，其比例一般为50～100∶1。在PCR反应的最初10～15个循环中，其扩增产物主要是双链DNA，但当限制性引物(低浓度引物)消耗完后，非限制性引物(高浓度引物)引导的PCR就会产生大量的单链DNA。 产生的ds-DNA与ss-DNA由于分子量不同可以在电泳中分开，而得到纯ss-DNA。 主要为测序制备ss-DNA，为了制备探针。 五、不对称 PCR 高浓度引物 低浓度引物 巢式PCR（nested PCR），利用两套PCR引物对（巢式引物）进行两轮PCR扩增反应。 第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，此产物在在内引物的存在下进行第二轮扩增。 六、巢式PCR P1 P2 P3 P4 巢式PCR的使用降低了扩增多个靶位点的可能性，因为同多套引物都互补的靶序列很少。 巢式PCR可以增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的灵敏度，并且提高了特异性。 彩色PCR（Color complement assay）是用荧光染料标记引物的5’端。 荧光染料JOE和FAM呈绿色荧光；TAMRA呈红色荧光；COUM呈蓝色荧光。 不同荧光标记的引物同时参加反应，扩增后的目的基因会分别带有引物5’端的染料，通过电泳就可以根据不同荧光的色泽直观判断目标基因是否存在及扩增基因的类型。 可用于基因诊断，如诊断基因缺失、染色体易位或感染某种病毒。可用更多的色彩，同时检测多种基因成分。特别适合大量临床标本的基因诊断 七、彩色 PCR 标记引物 ＰＣＲ 观察 PCR产物 A 正常人 病 人 正常 病人 ASO探针法 病人 A C T G ASO探针 正常 PCR-ASO检测基因点突变：主是利用PCR技术扩增靶基因的适当片段，然后用人工合成的含突变位点的标记寡核苷酸探针杂交 探针杂交 NC膜 探针 正常人 突变纯合子 突变杂合子 PCR-RFLP（restriction fragment length polymorphism 限制性片段长度多态体）法： 限制性核酸内切酶 恶性肿瘤（癌基因或抑癌基因） Ras基因 突变 限制性核酸内切酶 正常 突变 电泳 3. DNA和RNA的微量分析 PCR技术高度敏感，对模板DNA的量要求很低，是DNA和RNA微量分析的最好方法。 PCR后将待测DNA片段既可克隆到特定的载体进行序列测定，也可直接测定。 PCR技术引入DNA序列测定，使测序工作大为简化，也提高了测序的速度； 使用引物对靶序列进行扩增，就可掺入同位素或非同位素标记的各种碱基，获得所需比活性的探针 。 4. DNA序列测定 5. 用PCR标记DNA探针 mRNA 第二节 常用几种PCR反应 1)RNase 2)碱性液 (水解RNA) 单链DNA 逆转录酶 (使dNTP 聚合) RNA-DNA杂化链 PCR