第三讲_蛋白质组学工具_色谱和HPLC_v2_赵晓航_092611.pptVIP

等度洗脱（Isocratic elute）与梯度洗脱（Gradient elute） 流速： 3、凝胶色谱 由于所用的凝胶不受大多数缓冲离子的影响，所以，凡对拟分离样品稳定的离子均可用于缓冲液的配置。 选用洗脱剂的原则：能完全溶解拟分离的样品且对样品稳定；不影响对被分离样品的监测；易除去。 有些有机溶剂能使胶粒收缩或胀大，使用时要注意。 一般借助于重力或蠕动泵进行洗脱。 注意洗脱速度。 4、离子交换色谱 1）洗脱剂：通常有三种洗脱方法，选用的洗脱剂各不相同。 增加缓冲液的离子强度，使缓冲液中的离子与样品对吸附部位的竞争力加大，从而降低了样品对交换剂的亲和力而被解离；洗脱剂为两种不同离子强度的缓冲液，改变缓冲液的pH，使被分离样品分子的解离度降低，游离基团减少，同样降低对交换剂的亲和力，使样品解离；洗脱剂为两种不同pH的缓冲液，同时改变离子强度和pH。 洗脱方式：有三种： 等度洗脱法：最简单。洗脱缓冲液就是起始平衡缓冲液，如分离血清中的IgG（一元泵） 分段洗脱法：用几个具有不同离子强度或/和pH的缓冲液相继进行洗脱（二元或多元泵） 梯度洗脱法：用浓度或/和pH连续改变的洗脱液进行洗脱。这是实验室最常用的，也是最有效洗脱方法（二元或多元泵） 3、亲和色谱专一性洗脱 又称亲和洗脱。用于洗脱结合于特异性吸附剂上的物质或亲和结合力相对弱的物质（Kd为10－4 ～10－6mol/L）。如以酶抑制剂为配体分离酶时，可用酶的底物或底物类似物作为洗脱剂，通过竞争性地与酶结合而将酶洗脱下来。若用酶为配体分离酶的抑制剂时，可用酶的底物或底物类似物作为洗脱剂将酶的抑制剂洗脱下来。此时，洗脱剂是通过竞争性地与配体结合而将被分离物洗脱。 非专一性洗脱 缓冲液pH改变：pH变化可以改变结合部位的带电基团的离子化程度，从而成功地进行解析。极端pH如pH2.5或11的缓冲液均可用于亲和层析洗脱。 离子强度改变：离子强度增加大缓冲液可使某些结合物解离。NaCl是常用来增加离子强度的试剂。 极性的改变：降低缓冲液极性的物质可有效地抗原抗体复合物而不影响其活性（如10％二噁烷等）。 变形洗脱剂的应用：即能改变蛋白质结构的洗脱剂，包括一些蛋白变性剂和促溶剂。 （五）洗脱液的监测与保存 洗脱液的监测： 人工监测、洗脱图的绘制监测仪自动监测和自动记录仪绘制色谱图。 生物活性检测 保存：按样品性质不同或以溶液形式冰冻干燥后，分别于低温或常温保存。 检测器 HPLC主要的用途是分析分析的基本是对目标组分进行定性和定量，而定性定量的前提是其显示的信号能够被检测。因此，作为一个强有力的分析工具，HPLC必须配制与其相应的检测器 理想检测器应具有的特性：灵敏度高；能检测的样品范围广；检测样品需要量低，噪音低，最低捡知量低；线性范围宽；不受温度、洗脱液及其流速的影响；操作方便、耐用等。 检测器的类型： 通用型检测器：可连续测量色谱柱流出物（包括洗脱液和样品组分）的全部特性变化。如视差折光检测器、介电常数检测器、电导检测器等。 专一型检测器：用以测量被分离样品组分中某种特性的变化。（该特性是洗脱液所不具有的）。如紫外检测器、荧光检测器、极谱检测器及放射性检测器等。 紫外检测器：是最长用的检测器，通用性好。因为相当大一部分的化合物具有紫外吸收或可以通过化学衍生等方法使之产生紫外吸收。紫外检测器具有相对较强的响应能力，灵敏度高，最低检知量低。是浓度依赖型检测器，可用于定量分析。根据被分析样品特性、量及洗脱剂的特性作选择。 生物活性的检测非常重要 色谱柱的保存 反相柱一般保存于90％乙腈中。 凝胶过滤柱的保存：样品洗脱完毕即可再次使用。保存过程中不能冰冻，要注意防腐（防腐剂：0.02%叠氮钠或三氯丁醇、0.05%硫柳汞） 离子交换柱的保存：洗脱后柱床体积会改变，需再生、转型后方能使用。离子交换葡聚糖凝胶柱需重新装柱后使用 亲和层析柱的保存：清洗后可反复使用。重复使用的限度（次数），取决于样品的性质以及载体与配体对所用洗脱条件的稳定性。保存于80C以下，但不能冰冻。 根据样品的特性，尤其是样品的稳定性，选择适当的保存方法。如： 溶液直接冷藏 冷冻干燥 有机溶剂沉淀（如制成丙酮粉保存） 样品的保存 一般增加分辨率的因素 增加柱的长度（增加塔片数，增加柱效） 降低流速 选用合适的、均一的固定相(填充介质） 以改善柱的均一性 降低上样量 选用合适的流动相（洗脱剂） 选用合适的工作压 选用剃度洗脱法 四、高压液相色谱（HPLC） 在层析理论上，英国生物学家1952年诺贝尔奖得主Martin和Synge曾经提出使用非常细的颗粒填料,并在柱两端施加较大的压差，这