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第九章 植物基因的遗传转化;第一节 DNA直接导入基因转化;DNA直接导入转化就是不依赖农杆菌载体和其他生物媒体，将特殊处理的裸露DNA直接导入植物细胞，实现基因转化的技术。（又成无载体DNA介导转化） DNA直接转化技术根据其原理可分为化学法和物理法两类。; 一、PEG介导基因转化; 一）原理;二）步骤;三）转化率及影响因素 ;DNA构象对转化率有很重要影响，线性DNA比环形DNA对植物细胞的转化更有效； 加入携带DNA能提高转化效率，如鲑鱼精DNA； 在细胞周期的S期或M期时的转化率明显高于其它时期，可以用2、4－二氯甲晴处理，使细胞进入S期和M期，提高转化率 在PEG处理前，用低剂量x射线或紫外线处理原生质体，可使更多的细胞有效地整合外源基因； ;外源DNA的浓度对转化的影响：在一定DNA浓度范围内（10－60ug/ml），转化率随DNA浓度增加而递增； 原生质体的浓度的影响：原生质体1.0x106个/ml比较好； PH值对PEG转化的影响；当PH5.8-6.0时，转化处理后的原生质体分散性好，转化率高。 ;四）特点;二）电击法介导基因转化;分离的原生质体加入电击缓冲液，将原生质体密度调节到1x106－2x106个/ml； 加入质粒DNA(10ug/ml)和鲑鱼精DNA（50ug/ml），混合后分装于电击反应槽内； 冰浴10min； 600r/min离心3min除去电击缓冲液，用液体培养基洗涤； 将原生质体包埋于固体培养基中，28度黑暗调节下选择培养。;二）转化率及影响因素;在电击处理时，有PEG存在对转化率有重要促进作用； 加入运载DNA可以提高转化率； 原生质体所处的介质成分也会影响转化率，原生质体应悬浮在便于进行电击的具有特定电阻的盐溶液中； 其它因素如Ca离子浓度、PH值，质粒DNA浓度对转化率都要影响。 ;三）特点;三、基因枪法介导基因转化;根据基因枪的动力系统，可分为三类： 第一类是火药爆炸力为加速动力。 第二类是以高压气体作为动力，如氦气、氢气、氮气等； 第三类是以高压放电为驱动力。其最大的优点是可以无极调速，通过变化工作电压，粒子速度及射入浓度可准确控制，使载有DNA的金（钨）粉粒子能到达具有再生能力的细胞层。;三）步骤;四）转化率及影响因素;DNA的纯度及浓度对转化率的影响：DNA纯??越高越容易获得成功的转化，另外，加入携带DNA可提高转化率，但混杂的DNA其干扰作用； 在一定范围，DNA浓度高，可以获得较好的转化效果，但DNA浓度过高也会使金属微粒凝聚成块，反而降低转化率。 微弹速度的影响：基因枪的轰击参数，如粒子速度、入射浓度、阻挡板至样品室外的高度、轰击次数等均影响基因介导转化率，其中微弹的速度是影响转化率的一个重要因素。它直接决定了微弹对细胞和组织的作用力及产生损伤的程度。;植物材料的内在因素的影响：在基因转化中起主导作用是植物细胞本身，因此，植物受体细胞本身的因素在转化中起主要作用。 这些生物因素包括外植体的种类、细胞的生理状态、细胞潜在的再生能力、轰击前后的培养条件以及细胞内环境对外源DNA的接受能力等等。 一个重要原则是潜在分裂能力的细胞才具有接受外源DNA的可能。 ;五）特点; 需进一步研究的问题： 基因枪的硬件设计尚待改善； 微 弹的表面结构、大小、均一性及承载DNA 的量及DNA微粒载体的制备技术； 特定物种，特定组织、细胞的轰击条件； 如何诱导更多的细胞同时成为转化和再生感受态； 轰击后进入受体细胞的DNA生物学变化及其调控等理论问题。 ;第二节 种质系统介导基因转化;一、花粉管通道法介导基因转化;二）操作程序;外源DNA 导入受体植物 1）柱头涂抹法； 2）柱头切除法； 3）花粉粒吸入法； 后代材料处理 ;三）技术评价; ;四）存在问题;二、胚囊、子房注射法介导基因转化; 外源DNA制备； 外源DNA注射的时间，原则上注射的时间应在卵细胞受精后，到第一次细胞分裂前这段时间，外源基因易于整合； 外源DNA注射的部位； 操作； 后代材料的筛选； ;第三节 农杆菌介导的基因转化;一）植物基因工程载体的种类及特性;目的基因的克隆载体：通常由多拷贝的大肠感觉质粒为载体，其功能是保存和克隆目的基因。 中间克隆载体：由大肠杆菌质粒插入T-DNA片段及目的基因、标记基因等构建而成。是构建中间表达载体的基础质粒。 中间表达载体：是含有植物特异启动子的中间载体，其功能是作为构建转化载体的质粒。 卸甲载体：是解除武装的Ti质粒或Ri质粒，其功能是作为构建转化载体的受体质粒。 植物基因转化载体：是最后用于目的基因导入植物细胞的载体，亦称工程载体。它由中间表达载体和卸甲载体构建而成。分为一元载体系统和双元载体系统。;二）根癌农杆菌Ti质