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试验二重组DNA的提取及酶切鉴定
实验二 重组DNA的
提取及酶切鉴定
复旦大学上海医学院医学实验教学中心
王松梅
021 smwang2@fudan.edu.cn
1
一、实验目的
掌握以下方法和技术：
1. 质粒DNA的小量快速制备
2. 质粒DNA的限制性内切酶酶切
3. DNA的琼脂糖凝胶电泳
2
二、实验原理
1. 质粒DNA的小量快速制备
分离质粒DNA有三个步骤：
1）培养细菌使质粒扩增
2）收集和裂解细菌（本实验：SDS裂解）
3）分离和纯化质粒DNA （本实验：碱变性法）
3
碱变性法抽提质粒DNA
Solution II Solution III
离心后去向
pH12.6 pH4.8
氢键断裂，双螺
染色体DNA 不能完全复性 沉淀中
旋解开
氢键部分断裂，
质粒DNA cccDNA互补链 复性 上清中
不完全分离
4
质粒的纯化方法
层析法：常用
离心法：经典，纯度高
电泳法
沉淀法：大量
硅基质材料(树脂）纯化质粒DNA
DNA分子中的磷酸二酯键骨架在盐溶液的作用下脱水，使
得暴露的磷酸基团吸附硅胶。双链DNA分子一旦被硅胶吸
附，一般的洗液不能将其洗脱下来，只有水溶性的缓冲液，
如TE或水重新水化后，DNA才能从层析柱上定量回收。
6
2. 质粒DNA的限制性内切酶酶切
c-myc基因片段4.8 kb BamH I + Xba I双酶切（酶切完全时）
琼脂糖凝胶电泳凝胶中2条区带
pSV-c-myc
8.3kb 3.5kb pSV2载体片段
BamH I 4.8kb c-myc 目的基因片段
Xba I
pSV2载体片段
3.5kb
7
3. 琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖——海藻中提取的线状高聚物
加热融化成清澈、透明的溶液
凝固后成凝胶
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