基因工程与药物教学教材.ppt

基技学院 严永敏 ;概 念;自然界的基因重组;转导作用 概念：以病毒为媒介发生在供体细胞与受体细 胞之间的DNA转移及基因重组。;转位： 概念：基因从基因组的一个位置转移到另一个位置。;进 展;Psclol;第一节 概述 第二节 基因工程相关的酶学 第三节 基因工程的载体（vector） 第四节 目的基因制备和常用分离方法 第五节 载体DNA和目的基因的连接 第六节 重组DNA分子引入受体细胞 第七节 重组体的鉴定与分析 第八节 克隆基因的表达;分 切 连 转 筛;基因工程;基因工程技术的应用(P307); 在分子克隆技术中，对DNA进行切割、合成、补平、连接和修饰等工具酶是必不可少的。 常用的工具酶主要有： 限制性核酸内切酶、DNA聚合酶Ⅰ、逆转录酶、DNA连接酶、碱性磷酸酶、多核苷酸激酶和末端脱氧核苷酸转移酶，甲基化酶等。;一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease，RE）;作用 Ⅰ Ⅱ Ⅲ;（一）限制酶的命名与分类;（二）Ⅱ型限制性核酸内切酶的作用; Ⅱ型限制酶的特异识别序列 回文结构（palindrome structure）： 指双链DNA分子上按对称轴排列的反向互补序列。;粘性末端（cohesive　end）： 指限制酶错位切开两条对称轴互补DNA双链所产生的带单链突出的末端。;4;;;同裂酶（isoschizomers）: 来源不同，但能识别和切割同一核苷酸序列的限制酶，也称异源同工酶。 ; 如： BamH Ⅰ（G GATCC） 和Sau 3A Ⅰ（N GATCN）。;“分子剪刀”的应用 ; 人类两个个体的基因组DNA中平均有1000万处不同，多位于非编码序列中。碱基的变异可能导致酶切点的消失或新的切点出现，当使用同一限制酶切割不同个体基因组DNA时，DNA片段长度出现差异，这种由于内切酶切点变化所导致的DNA片段长度的差异，称为RFLP 。 ;GAATTCCTTAAG; RFLP在遗传病检测中的应用;一、限制性核酸内切酶;作用 Ⅰ Ⅱ Ⅲ;（二）Ⅱ型限制性核酸内切酶的作用;回文结构（palindrome structure）： 指双链DNA分子上按对称轴排列的反向互补序列（常为限制酶所识别）。;粘性末端（sticky　end）： 指限制酶错位切开两条??称轴互补DNA双链所产生的末端。;图4-1 回文结构和限制性核酸内切酶作用模式图;二、DNA连接酶;图4-4 DNA连接酶作用模式图; ;Klenow片段的主要用途： ① 补齐双链DNA的3?末端，同时可使3 ?末端DNA标记同位素。 ② cDNA克隆中，合成cDNA第二链。 ;（二）Taq DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶（简称Taq 酶）是一种耐热的DNA聚合酶，分子量为65Kd，最佳作用温度是70~80℃，Taq酶具有5?→3? 聚合酶活性和依赖于聚合作用的5?→3?外切酶活性。Taq DNA聚合酶可用于DNA测序及通过聚合酶链反应（PCR）对DNA分子的特定序列进行体外扩增。 ;① RNA指导的DNA聚合酶活性（RDDP）。 ② 核糖核酸酶H活性（RNaseH） 。 ③ DNA聚合酶活性（DDDP）。;5?; 末端脱氧核苷酸转移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT，简称末端转移酶）分子量为60Kd，在二价阳离子存在下，催化脱氧核糖核苷酸转移到单链或双链DNA分子的3?末端-OH上。;(A、G、C、T)n;五、碱性磷酸酶;第二节 载体; ①能自我复制并具较高的拷贝数。 分子量一般 10Kb。 ②带有遗传筛选标记。 ③有适当的限制酶切位点，便于外源基因的插入和筛选。 载体上具有多个限制酶的单一切点（即在载体的其它部位无这些酶的相同切点）称为多克隆位点（multiple cloning sites，MCS） 。;多克隆位点;质粒(plasmid)载体 噬菌体(phage)载体 真核病毒(virus）载体; ;一、克隆载体;　质粒与宿主细胞的关系 （1）质粒对宿主的生存不是必需的，只是“友好”的“借居”宿主细胞中 （2）质粒离开