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第七章：DNA重组技术 一、DNA体外重组的基本含义 二、限制性内切酶 三、DNA体外重组常用的工具酶 四、常用的载体 五、目的基因的获得 六、外源基因的表达系统 一、DNA重组技术的基本含义 1、基本概念 • DNA重组技术也称为基因克隆或分子克隆。最终 目的是把一个生物体中的遗传信息（DNA ）转入 另一个生物体。 2 、基本步骤 • 目的基因的提取:供体生物基因或称外源基因的提取 •限制性酶切：目的基因切成不同大小的片段 •酶接：连接到另一DNA分子上（克隆载体） •转化:将这个重组DNA分子转入受体细胞 •筛选和鉴定:对吸收了重组DNA 的受体细胞进行筛选和鉴定 •基因表达：进行培养，检测外援基因是否表达。 二、限制性内切酶 1、限制性内切酶的定义 • 是指已被证明是限制修饰系统中的一个组成部 分，具有识别双链DNA分子中的某种特定核酸序 列并由此切割DNA双链结构的酶统称为限制性内 切酶。 2 、限制性内切酶的发现 • Luria和Human发现细菌能将外来的DNA片段 在某些专一位点上切断，从而保证其不被外来 噬菌体所感染，而其自身的DNA 由于被一种特 殊的酶所修饰（甲基化）而得以保护，这种现 象叫做限制－修饰。 • Smith和Wilcox 从流感嗜血杆菌中分离到一种 酶，能够特异性的切割DNA ，这个酶被命名为 Hind I,这是第一个分离到的限制性内切核酸 酶。 3 、限制性核酸内切酶的命名 • 按酶来源菌的属、种名而定，取属名的第一个 字母与种名的头两个字母组成的三个斜体字母 作略语表示；如有株名，再加上一个字母，其 后再按发现的先后写上罗马数字。例如：从流 感嗜血杆菌d株（Haemophilus influenzae d ） 中先后分离到3 种限制酶，则分别命名为 Hind Ⅰ、Hind Ⅱ和HindⅢ。 4、限制性内切酶的类型 限制性内切酶可分为三大类型： • 类型I和类型III ：由于识别位点并非严格专 一，很少被应用。 • 类型II ：是DNA重组技术最为常用的工具酶。 类型II 限制性内切酶的特点 • 识别位点严格专一 • 识别序列的碱基数一般为4、6、8个bp • 识别位点经常是一种回文序列的DNA 5、常见的限制性内切酶 限制性核酸内切酶名称 识别序列和切割点 EcoR Ⅰ G ↓AATTC Hind Ⅱ GTPy ↓PuAC Hind Ⅲ A ↓AGCTT BsuR I GG ↓CC Pst Ⅰ CTGCA ↓G Sma Ⅰ CCC ↓GGG Xba Ⅰ T ↓CTAGA Xho Ⅰ C ↓TCGAG BamH Ⅰ G ↓GATCC Not Ⅰ GC ↓GGCCGC 6、限制性内切酶的切割方式 就切割位点相对于对称轴的位置而言,切割方式 有三种: • 在对称轴5 侧切割产生5 粘端 • 在对称轴3 侧切割产生3 粘端 • 在对称轴处切割产生平段 5‘