波普分析蛋白质环化.ppt

* * * * * * * * 天然蛋白质通过内部共价键环化折叠而稳定 READY? Now Loading… 主讲： 翻译： PPT制作： 课题的提出 问题解决方法 得到的结论 问题与展望 蛋白质骨架环化是一种可在解叠状态减少构象熵值的新方法。蛋白质的 N 端和 C 端生成一个天然的肽键，达到蛋白质环化的目的。天然蛋白质由于环化内部缺少张力，其稳定的自由能源于出现变性使得蛋白质环化的构象熵减少。对于氨基酸序列相同的线型和环形蛋白质，其伸展的自由能ΔG不一样，环化减小蛋白质的构象熵值，从而使环形蛋白质更加稳定。 蛋白质环化：通过灵活的蛋白质环化链接实验，引入构象张力来定量评估环化蛋白质！！！ 问题解决方法 蛋白质单体样品的制备： 1.二聚体链接处带电的谷氨酸代替苯丙氨酸 2.用核磁共振测定质子迁移速率。 3.为了获得相同的氨基酸序列重新设计lin-DnaBN(F102E)和cz-DnaB-N(F102E)。 DnaB-N的突变体（残基24-136）：其构造和研究是通过圆二色性和电离质谱来定量评估对环化的影响。 DnaB-N的N端和C端三维空间结构和天然蛋白质的核心结构在空间是接近的，这样的结构允许通过小的、灵活的缩氨酸缓和而不影响中心结构。已经通过NMR和结晶方法确定结构DnaB-N是一个完全螺旋的单体蛋白质，如图所示。 问题解决方法 箭头标识突变的位置。（a）中通过内含肽介导的环化引入的酰胺键用箭头突出显示，N和C末端中的天然蛋白质标注于括号中。 问题解决方法 酰胺键质子交换速率的测定：通过核磁共振和质谱分析测定酰胺键质子交换速率，显示基本所有的质子交换速率最快的大约是最慢的10倍。 环化稳定性评估：大肠杆菌突变体N端DnaB解旋酶作为一个模型来评估共价环化的稳定性，在高浓度的情况下实现苯丙氨酸102突变成谷氨酸，线型和环形伸展的自由能ΔG是不一样的，在10oC通过圆振二向色性测得ΔG与理论通过三维晶格能预测线型和任意环形构象熵的差值均为2.3kcal/mol 评估蛋白质环化反应的影响： 1.建立网状格模型来预测未折叠蛋白质的构象熵 2.根据构象熵的差值推断稳定化自由能 3.通过N端解旋酶DnaB-N(F102E)的酰胺质子交换和蛋白质重折叠速率，来说明环化是否影响蛋白质稳定性 稳定性比较 环形蛋白质比线性蛋白质明显更稳定。但是，不能通过热力学基础来评估环化的稳定性。 首先，不是天然氨基酸序列的一部分，缺少直链N端DnaB解旋酶； 其次，DnaB-N在高浓度下毫克分子之间相互吸引形成二聚体，高度依赖解链温度和热力学参数 得出的结论 核磁共振的变化曲线几乎没有在低浓度达到尿素的平台值，表明蛋白容易展开。 得出的结论 环化稳定自由能: ?Gcz=—RTlnWcz 线型稳定自由能： ?Glin=—RTlnWlin 所以，二者稳定自由能差值： ??G= ?Gcz- ?Glin Wcz、Wlin分别代表环型、线型可能构型数 环形蛋白质在折叠状态时链接肽会被更多地抑制。从而导致环形蛋白质的构象熵小，更加稳定！ 得出的结论 N=6, Wcz/Wlin=0.0149 所以，得： ??G= 2.3 kcal/ mol (Tem:10℃) 得出的结论 用点阵模型计算Wcz/Wlin得出 ??G=2.3(±0.5)kcal/mol (10℃) 模型预测的??G数据是2.6kcal/mol (10℃) 环化稳定自由能??G的预测值和测量值相吻合，都说明了环形比线性蛋白质稳定。 得出的结论 绝大部分交换慢的酰胺质子的交换速率是非常均匀的，独立于氨基酸残基的类型和主要结构 把冰冻的蛋白质溶于2H2O 用NMR检测其交换过程 *