第二章 生物细胞培养基制备过程与设备推荐.docVIP

第二章 ?生物细胞培养基制备过程与设备 ? 所有的生物细胞都要不断地同外界进行物质和能量交换，都要进行新陈代谢，才能表现出生命活动，这时，就需要营养物质。营养物质包括碳源、氮源、微量元素、维生素等。利用生物细胞进行生物加工时，需要根据不同的细胞配制多种多样的培养基，有的细胞能利用淀粉，这时直接向培养基添加淀粉；有的仅能利用葡萄糖，这时就要用纤维素、半纤维素或各种工农业副产物来制备培养基。生物技术产业中大多数都利用纯种培养技术，这就要求对培养基中已有的杂菌进行去除或杀灭。 第一节? 液体培养基的灭菌 灭菌是指利用物理或化学方法杀灭或除去物料及设备中一切有生命物质的过程。常用的灭菌方法大致有以下几种：化学灭菌法，电磁波、射线灭菌法，干热灭菌法，湿热灭菌法，过滤除菌法，火焰灭菌法。 发酵工业自从采用纯种培养以后，产物的产量和质量都有了很大的提高，同时对防止染菌的要求也更高了。目前的各种培养过程往往都要求在没有杂菌污染的条件下进行，由于培养过程中通常含有比较丰富营养物质，且培养基中常常带有各种微生物，因此很容易受到杂菌的污染，进而会产生各种不良的后果。 （1）由于杂菌的污染，使生物反应中的基质或产物因杂菌的消耗而损失，造成生 产能力的下降； （2）由于杂菌所产生的一些代谢产物，或在染菌后改变了培养液的某些理化性质，使 产物的提取和分离变得困难，造成收率降低或使产品的质量下降； （3）杂菌会大量繁殖，会改变反应介质的PH值，从而使生物反应发生异常变化； （4）杂菌可能会分解产物，从而使生产过程失败； （5）发生噬菌体污染，微生物细胞被裂解，而使生产失败等等。 由此可见，培养基灭菌是否彻底直接关系到生产过程的成败，轻则导致所需要的产品产量锐减，质量下降，后处理困难，重则使全部培养液变质，导致成吨的培养基报废，造成经济上的严重损失，这一点对大规模的生产过程更为突出。所以，为了保证培养过程的正常进行，防止染菌的发生，对大部分微生物的培养，包括实验室操作和工业生产，均需要进行严格的灭菌。工业上，培养基、发酵设备一般都采用蒸汽湿热灭菌。 一、湿热灭菌原理和影响灭菌的因素 在发酵工业中，对培养基和发酵设备的灭菌，广泛使用湿热灭菌法。工厂里，蒸汽比较容易获得，控制操作条件方便，是一种简单而又价廉、有效的灭菌方法。用湿热灭菌的方法处理培养基，其加热温度和受热时间与灭菌程度和营养成分的破坏都有关系。营养成分的减少将影响菌种的培养和产物的生成，所以灭菌程度和营养成分的破坏成为灭菌工作中的主要矛盾，恰当掌握加热温度和受热时间是灭菌工作的关键。 （一）灭菌动力学 微生物受热而破坏是指其生活能力丧失，微生物热死灭原因是细胞内的反应。 （1）对数残留定律 微生物受热死亡的原因，主要是因高温使微生物体内的一些重要蛋白质，如酶等，发生凝固、变性，从而导致微生物无法生存而死亡。微生物受热而丧失活力，但其物理性质不变。在一定温度下，微生物的受热死亡遵照分子反应速度理论。在灭菌过程中，活菌数逐渐减少，其减少量随活菌数的减少而递减，即微生物的死亡速率与任一瞬时残留的活菌数成正比，如图2-1所示，大肠杆菌的死亡曲线为线性关系，称之为对数残留定律，也即反映为一级化学反应动力学为： ????????????????????????????????????? ??????????????（2-1） 式中? ——残存的活菌数； ——灭菌时间，s； ——灭菌速度常数（s-1），也称反应速度常数或比死亡速度常数，此常数的大小与微生物的种类与加热温度有关； ——活菌数瞬时变化速率，即死亡速率。 上式通过积分可得： ??????????????????????? ???????????????（2-2） 式中 ?——开始灭菌（t=0）时原有活菌数； ——经时间t后残存活菌数。 上式是计算灭菌的基本公式，灭菌速度常数是判断微生物受热死亡难易程度的基本依据。各种微生物在同样的温度下K值是不同的，值越小，则此微生物越耐热。 若要求灭菌后绝对无菌，即=0，则从上面公式可以看出灭菌时间将等于无穷大，这是不可能的，故培养液灭菌后，以在培养液中还残留一定活菌数进行计算。工程上，通常以=10-3个/罐，即杂菌污染降低到被处理的每1000罐中只残留1个活菌的程度，此数已满足生产要求。 （2-2）式是理论灭菌时间的对数残存规律公式。但实际上蒸汽加热灭菌时间则以工厂的经验数据来确定，通常高温灭菌时间约为15~30s，然后根据发酵类型不同在维持罐维持8~25min。对谷氨酸发酵，培养基粘度低，营养丰富，维持时间可采用8~10min。 90%死灭时间：所定条件为活的微生物90%死灭所需的时间，也称1/10衰减时间。 从公式2-2得： 则 ??????????????????????? ?????????????????