生物工程下游技术--沉析.pptVIP

3.1 概述 * * Chapter 3沉淀(沉析) Precipitation 3.1 概述 3.2蛋白质的表面特性 3.3蛋白质沉淀方法 4.1.1 沉淀(precipitation)概念 物理环境的变化引起目的物或杂质的溶解度降低，从而形成不定形固体凝聚物(aggregates)的过程。多用于蛋白质及多糖类等物质的初级分离。 ? 3.1.2 沉淀法的应用 主要应用于生化产物的分离，其典型例子是蛋白质(酶)的分离提取，在实验室和工业规模均得到广泛应用。 3.1.3 沉淀法分离蛋白质的特点 ①在生产的前期就可使原料液体积很快地减小10~50倍，从而简化生产工艺、降低生产费用； ②使中间产物保持在一个中性温和的环境； ③可及早地将目标蛋白从其与蛋白水解酶混合的溶液中分离出来，避免蛋白质的降解，提高产物稳定性； ④用蛋白质沉淀法作为色谱分离的前处理技术，可使色谱分离使用的限制因素降低到最少。 ⑤缺点：所得沉淀物可能聚集有多种物质，或含有大量的盐类，或包裹着溶剂，产品纯度较低。 3.1.4一般沉析操作的过程 在经过滤或离心后的样品中加入沉析剂； 沉淀物的陈化，促进晶体生长； 离心或过滤，收集沉淀物； 3.2 蛋白质的表面特性 1)、蛋白质为两性高分子电解质(amphoteric polymer)，其正负电荷是由氨基和羧基的离子化形成的。其包含疏水性和亲水性的氨基酸基团，其亲水和疏水区域的分布和程度决定蛋白质在水相环境中的溶解程度。但大部分蛋白质是可溶的，其亲水性氨基酸残基分布在蛋白质立体结构的外表面。蛋白质表面由不均匀分布的荷电基团形成的荷电区、亲水区和疏水区组成。 2)、蛋白质分子周围存在与蛋白质分子紧密或疏松结合的水化层(hydration shell)，从而使蛋白质在水溶液中呈现稳定的胶体溶液(colloid)而不易沉淀。 3)、偏离等电点的蛋白质为带电粒子，在电解质溶液中吸引相反电荷的离子(反离子，counterion)。紧靠蛋白质表面的反离子层不流动(紧密层，Stern layer)，靠近外围的反离子浓度逐渐降低直至为零(分散层，gouy-Chapman layer)，从而形成蛋白质的双电层(electrical double layer)。双电层中存在从表面由高到低的电位分布，由于粒子表面电位一定，所以分散层厚度赿小，双电层交界处的ξ电位赿小。分散层厚度为零，ξ电位为零，粒子处于等电状态，无静电相互作用。当双电层的ξ电位足够大时，静电排斥作用抵御分子间的相互吸引作用，使蛋白质处于稳定状态。 4)、降低蛋白质的水化层和双电层厚度可降低蛋白质溶液的稳定性，使蛋白质沉淀。加入沉淀剂可达到目的。 ? 3.3 蛋白质沉淀方法 按加入沉淀剂的不同分为： 加入中性盐盐析； 加入可溶性有机溶剂； 将pH值调节到等电点； 加入非离子型亲水性聚合物； 加入聚电解质絮凝；加入多价金属离子等 选择沉淀方法时，应考虑以下几个因素： 沉淀剂是否会引起蛋白质分子的破坏 沉淀剂本身的性质、沉淀操作的成本和 难易程度、 残留沉淀剂的去除难度 最终产品的产率及纯度的要求 3.3.1 盐析沉淀(Salt induced precipitation) 1) 盐析原理 蛋白质在高离子强度的溶液中溶解度降低，从而发生沉淀的现象为Salting-out. 其中：S—蛋白质的溶解度，g/dm3；β—常数；Ks—盐析常数；I—离子强度，mol/dm3；ci—离子i的摩尔浓度(mol/dm3)；Zi—电荷数 Ks为直线的斜率，由蛋白质和盐的种类决定，与T，pH无关； 当I为0时，β＝logS，即为纵向延伸截距，与蛋白质、T、pH有关，与无机盐无关。 Cohn Ks　 S　　 盐析效果好　　ci和、Zi　增大 β　 S　 盐析好　　等电点下βmin T　 β　――好 盐离子与蛋白质表面异电荷结合 离子对 电性降低 降低 电排斥 低浓度的盐离子 电荷增加 促溶 　盐溶现象(Salting in) 高浓度： 脱水膜 蛋白质暴露出疏水小区 溶解度降低 沉淀 2）盐析方法 ①　Ks盐析法：一定的pH和T下通过改变盐离子浓度进行盐析，此时β影响较小，此法由于蛋白质对离子强度的变化非常敏感，易产生共沉淀现象，沉淀的分辨率低，故常用于提取液的前处理。 ②　β盐析法：一定的盐离子浓度下改变pH和T进行盐析，β影响较大，用于后期，分辨率高。 3）影响盐析的因素 ①盐的种类和浓度：即Ks值不同，一般是多价阴离子、单价阳离子的盐析作用强。即浓度愈大，共沉作用加强，分辨率降低，效果降