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丙泊酚对心肌细胞 Bcl-2 、Bax蛋白表达的影响 　　　　　　　　　　 黑龙江省医院　麻醉科 　吴双全 　　　　　　 摘要：本文主要阐述丙泊酚对Bcl-2、Bax 蛋白表达的影响，从而从另外一个角度说明丙泊酚对心肌的保护作用．资料与方法：培养的心肌细胞随机分为5组，每组10个样本，既正常对照组，阿霉素（ADR）损伤组，25 μmol/L丙泊酚（PR）＋ADR组，50 μmol/L PR＋ADR组，100 μmol/L PR＋ADR组．通过电镜观察以及免疫组化方法检测Bcl-2、Bax蛋白表达变化．结果：ADR损伤组Bcl-2蛋白表达水平高于对照组（P 0.05）；PR（50 μmol?L－1Bcl-2蛋白表达水平高于ADR损伤组（P 0.01）．与损伤组比较，Bax 组细胞胞浆内棕黄色颗粒减少，并且染色较浅（图6，C）。ADR损伤组Bax蛋白表达水平高于对照组（P 0.01）；PR（50 μmol?L－1Bax蛋白表达水平低于ADR损伤组（P 0.05）．结论：从Bcl-2、Bax 蛋白表达的变化可以看到丙泊酚的心肌保护作用． 关键词：丙泊酚，Bcl-2、Bax 蛋白，心肌保护作用． 丙泊酚对心肌的保护作用已经有很多的报道。但是对Bcl-2、Bax 蛋白 蛋白表达的影响还没有报道。本文将从细胞学的角度来观察丙泊酚对心肌的保护作用。 资料及方法： (一) 原代培养的心肌细胞的准备 将出生1-3天的Wistar乳鼠浸泡70%的酒精中消毒，开胸后取心室肌，用Hanks液清洗2次，剪碎，放入10ml离心管中；离心管中装有5倍体积的0.25%胰酶，37℃消化10分钟后，加等体积的RPMI-1640全培养液终止消化，自然沉淀；取出沉淀物，放入另一盛有胰酶的离心管中，重复上述消化过程4次，每次37℃20分钟；收集除第一次以外的上清液，1500rpm离心15分钟，弃上清，用含10％胎牛血清的高糖 DMEM培养液充分而轻柔地吹打成单细胞悬液，经 200 目筛网过滤去除未消化组织块。然后按差速贴壁分离法 37℃、5%CO2 孵育 1-1.5 小时，纯化心肌细胞。细胞计数，相同密度接种于培养瓶中，37℃，5%CO2条件下培养。于培养后12 h 即可见部分细胞收缩,24 h 后换液,此时心肌细胞约9 0 %以上都在收缩, 速率达96/ min～120/ min 。以后每3 d 换1 次液,取第4 天的细胞进行实验研究。 (二) 实验分组 培养的心肌细胞随机分为5组，每组10个样本，具体为： 1、正常对照组：正常细胞培养，不做任何处理； 2、阿霉素（ADR）损伤组：在培养液中加入ADR，使其终浓度为1 ng/ml； 3、25 μmol/L丙泊酚（PR） （三）电镜观察培养心肌细胞超微结构改变 25cm2培养瓶培养3d的细胞，在药物作用结束后，用PBS轻轻洗涤细胞2～3次，收集细胞，用2.5%戊二醛固定24h，脱水，包埋，超薄切片，透射电镜下观察心肌细胞超微结构。 （四）免疫组化方法检测Bcl-2、Bax蛋白表达变化 细胞在经4%多聚赖氨酸预处理的盖玻片上（盖玻片放置于24孔培养板内）培养，终止培养后取出24孔板内的玻片进行如下操作： 用PBS冲洗三次，多聚甲醛固定30min； PBS冲洗，Triton作用15min； PBS冲洗，3%H2O2作用10min； 4、PBS冲洗，抗原热修复：将玻片放入盛有柠檬酸盐缓冲液的耐热容器中，置于微波炉内加热至94～98℃后，在保温20min，取出容器，放在室内，使之自然冷却至室温； 5、倾去血清，滴加Bcl-2、Bax一抗（兔抗大鼠），湿盒中过夜； 6、PBS冲洗，滴加二抗（山羊抗兔），37℃孵育20min； 7、PBS冲洗，二氨基联苯胺(DAB)染色； 8、苏木素复染1min，蒸馏水冲洗蓝化。 在高倍镜下随机计数10个视野，细胞核内含棕色颗粒为阳性细胞，计算阳性百分率。 四、统计学处理 计量资料数据以均数±标准差(±S)表示,组间比较采用t检验。阳性率的比较采用x２２检验。P 0.05表示差异显著。 结果： 　　 正常组心肌细胞胞浆内未见棕黄色颗粒状物质表达,心肌细胞形态较完整(图A)；ADR损伤组心肌细胞 Bcl-2 蛋白免疫细胞化学检测结果显示: Bcl-2 组心肌细胞胞浆内可见少量棕黄色颗粒状物质表达,染色较浅（图B）；丙泊酚保护组 Bcl-2 蛋白免疫细胞化学检测结果显示: 与损伤组比较 Bcl-2 组细胞胞浆内棕黄色颗粒增多，并且染色较深，呈弥漫性分布（图C）。ADR损伤组Bcl-2蛋白表达水平高于对照组（P 0.05）；PR（50 μmol?L－1）组心肌细胞Bcl-2蛋白表达水平高于ADR损伤组（P 0.01）。 　　　　　 　　　　　　　　　　A