奥赛生物北大孙静老师生化实验.ppt

生物奥赛实验 实验内容 1、 pET3a-RecA质粒电泳 2、 牛奶中的蛋白 3、 酵母糖酵解实验 4、 滤纸崩溃法测定纤维素酶活力 5、 PCR实验—性别鉴定 6、 微生物的分离技术 实验目的 比较质粒载体、重组质粒电泳时的迁移速度。 实验用具 锥形瓶，电泳仪，电泳槽，微波炉，微量可调移液器，DNA电泳图谱观察仪 实验用具 实验步骤 1．取出0.4g琼脂糖，倒入100ml的锥形瓶中，加入50ml 1x TAE缓冲液，摇匀，用封口膜将瓶口封住，放在微波炉内，至琼脂糖完全溶解。室温冷却至60℃左右； 问题：1、能否用蒸馏水，不用缓冲液溶 解琼脂糖？ 2、琼脂糖和琼脂有何区别？这里能否用琼脂代替琼脂糖？为什么？  2. 在水平操作台上，将胶槽放好，插入样品槽梳子，倒入60℃的凝胶。待凝胶冷却后，拔出样品槽梳子，将凝胶连同胶槽一起放入电泳槽。加入1x TAE缓冲液，缓冲液漫过胶块即可； 问题：1、为什么手指不能触摸凝胶？ 2、电泳时，电泳缓冲液为什么要漫过琼脂胶面？不漫过是否可行？为什么？ 3. 将重组质粒、质粒载体中分别各加入2ul染色液和2μl加样缓冲液，将离心管放在振荡器上混均，再用20μl的微量移液器分别取重组质粒20μl、质粒载体20μl，缓慢加入凝胶上样孔； 4. 加样完毕，盖上电泳槽，接好电源，调节电压至100V，开始电泳，当样品中溴酚蓝条带移动到凝胶前沿即可停止电泳； 问题：DNA电泳时，DNA是向正极还是向负极泳动？为什么？ 5. 观察电泳结果：电泳结束后，将电泳槽移至DNA图谱观察仪中，打开光源，在观察窗上观看电泳结果； 6．记录：将观察结果依比例划在图1中。 实验结果与分析   图谱上的质粒共有3条带，分别代表质粒的3种状态，迁移最快的是 状态的质粒，较慢的是 的质粒，最慢的是质粒 。 图谱上的质粒共有3条带，分别代表质粒的3种状态，迁移最快的是超螺旋状态的质粒，较慢的是线性的质粒，最慢的是质粒开环。 1．DNA电泳时，DNA是向正极还是向负极泳动？为什么？ 答：正极。 因为DNA是由脱氧核糖核苷酸通过磷酸酯键连接而成.DNA所带的电荷是由磷酸根带负电引起的,所以应该向正极移动. 2．为什么手指不能触摸凝胶？ 答：因为手指上的汗液含有蛋白、脂类等成份。这些成份会影响各样品槽中样品DNA的移动速度，从而严重影响凝胶条带的观察效果。 3．能否用蒸馏水，不用缓冲液溶解琼脂糖？ 答：蒸馏水溶解形成的凝胶,无法通过电流,不能使泳带分开和移动。 4．琼脂糖和琼脂有何区别？这里能否用琼脂代替琼脂糖？为什么？ 答：琼脂由琼脂糖（Agarose）和琼脂果胶（Agaropectin）两部分组成，琼脂糖是不含硫酸酯的非离子型多糖，是形成凝胶的组分，而琼脂果胶是非凝胶部分，是带有硫酸酯、葡萄糖醛酸和丙酮酸醛的复杂多糖。不能用琼脂代替琼脂糖，琼脂中含有的复杂多糖成分会干扰电泳结果，还会造成较亮的背景。 5．电泳时，电泳缓冲液为什么要漫过琼脂胶面？不漫过是否可行？为什么？ 答：电泳缓冲液漫过凝胶胶面可以使胶孔中的样品受到相同的电场力，不漫过琼脂胶面不可行，这样会干扰电泳结果。 实验目的 了解三氯乙酸（TCA）沉淀蛋白的特点，以及牛奶蛋白质等电点的测定 实验步骤—实验Ⅰ 1．取两支试管（1）和（2），各加入2ml奶粉溶液，在（1）号试管中再加入5滴三氯乙酸溶液，混匀后再加入0.5ml蛋白酶液，这一试管作为对照。在（2）号试管中，加入0.5ml蛋白酶液，震荡均匀后两试管静置30分钟。 问题：1、胰蛋白酶水解蛋白的产物是氨基酸，还是多肽 ？是内切酶还是外切酶？在胰脏中是否有胰蛋白酶活性？ 2、三氯乙酸在这里起什么作用 ？ 2. 30分钟后，再向（2）号管中加入5滴三氯乙酸溶液，混匀，再静置10分钟。  3. 分别吸取（1）和（2）号管中的上清液1ml 4000r/min离心5min，取上清0.5ml分别加入两个试管中。 4. 各加入3滴双缩脲试剂，观察并记录颜色变化，将实验结果填入表1。 问题：双缩脲试剂与上述清液反应后变色，双缩脲试剂测定的是什么？生成的产物是什么物质？ 实验步骤—实验Ⅱ 1. 在一个50ml三角瓶中加入5ml奶粉溶液，向奶粉溶液中加入4ml盐酸溶液，混合均匀后静置30秒观察记录现象，测定pH。 2. 在上述溶液中再加入4ml盐酸溶液，振荡均匀，静置30秒观察并记录现象，测定pH。 3. 在上述溶液中再加入2ml氢氧化钠溶液，振荡均匀，静置30秒观察并记录现象，测定pH。 4. 在上述溶