第8讲重组体在宿主细胞中表达与调控.pptVIP

重组体在宿主细胞中表达与调控 基因表达概述 基因表达概念 指基因携带的遗传信息，经过极其复杂的生物化学反应，最终产生具有生物功能的蛋白质的过程。 基因表达的过程 转录 合成mRNA 翻译蛋白质 基因表达的调节 转录水平的调控 转录产物的加工调节 RNA运输过程的调控 RNA降解的调节 翻译水平的调节 重组体在原核细胞中的表达 一、原核生物基因表达的特点 原核生物只有一种RNA酶，识别原核细胞的启动子（promoter）。 原核生物的基因表达是一操纵子（operon）为单位的。 原核生物缺乏转录后加工系统，所以外源基因必须用cDNA，不能用基因组。 原核生物基因表达的控制主要是转录水平。 原核生物基因具有特有的SD（Shine-Dalgarno sequence）序列，S-D序列是控制外源表达的重要控制元件 二 外源基因在原核细胞中表达的重要调控元件 1 启动子 启动子是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并能启动mRNA合成的序列。 原核启动子组成：两段高度保守序列组成。 操纵子 组成： 乳糖操纵子 2 核糖体结合位点 RNA有效的翻译除依赖于RNA的稳定外，还必须能够结合到核糖体上，即需要RNA上具有核糖体结合位点。 大肠杆菌的核糖体结合位点是SD序列。 是由AUG和一段AUG上游3-10bp的富含嘌呤的核酸序列，其可与16S RNA 3’末端富含嘧啶序列互补。 3 终止子（terminater） 是一个基因3‘末端特定的DNA序列，它具有被RNA聚合酶识别并停止转录的功能。 原核生物终止子特性： 包含一段富含A/T区和富含G/C区 在富含G/C区中具有回文结构 原核生物转录终止类型： DNA序列结构决定的茎环结构终止类型 ρ终止蛋白参与的终止类型 三 原核细胞表达载体介绍 1 非融合型表达载体 特点：单一表达外源基因的蛋白质 表达产物形成包函体，存在与大肠杆菌细胞内。 2融合型表达载体 特点：表达出的蛋白是融合蛋白，是外源基因的蛋白质与质粒上某一基因蛋白的融合体，外源基因编码的蛋白依据载体的不同，可以在前部，也可以在后部，通常可以用蛋白酶消化使二者分离。 表达产物形成包函体，存在与大肠杆菌细胞内。 3 分泌型表达载体 特点：可将表达的外源基因蛋白质分泌到细胞外。 优点：利于基因产物的收集、纯化。 重组体在真核细胞中表达的策略 一 哺乳动物细胞表达的优点 哺乳动物细胞能够识别和除去基因中的内函子，剪切加工形成成熟的mRNA。 对于翻译后的蛋白质还可以进行加工，增加获得具有生物学活性蛋白质的可能性。 二 哺乳动物细胞载体种类 整合型载体（integrated） 可将外源性基因整合到宿主基因组内，随宿主细胞基因组复制而扩增，并随宿主细胞分裂而传给子代细胞。 常见：逆转录病毒载体，SV4病毒载体等。 游离型载体（transient） 是以完整或缺陷病毒的形式携带外源基因，不整合到染色体上，以病毒颗粒的形式在宿主细胞内自我复制或在辅助病毒存在下复制。 常见：痘苗病毒载体；腺病毒载体；腺病毒伴随病毒载体等 三 真核细胞表达元件 哺乳动物细胞表达载体组成 原核DNA序列 启动子 增强子 拼接信号 终止子 多聚磷酸化信号 筛选标记 动物病毒基因序列 原核DNA序列 为了方便对动物病毒载体进行克隆操作、筛选、得到大量重组载体，使动物病毒载体能够在原核细胞中复制所必须的序列。 启动子 真核基因的基本转录单位包括基因转录起始点及其5‘上游启动子元件到转录终止处的全部DNA序列。 真核基因的启动子是基因表达时与启动相关的顺式作用元件，通常位于基因转录起始点上游，包括富含AT的TATA框，是引导RNA聚合酶II在正确起始位点转录所必需的DNA序列。 增强子 是使启动子的基因转录效率显著提高的一类顺式作用元件，由多个独立的核苷酸序列组成。 四 哺乳动物载体基因转移标记 新霉素抗性基因选择系统 利用新霉素（neomycin）的类似物，即G418（geneticin），是一类氨基糖苷类抗生素，可影响80s核糖体的功能和蛋白质合成，对真核细胞产生毒性。细菌的新霉素抗性基因neo编码一种3‘-磷酸转移酶，可使G418失活。 若将neo基因重组到真核细胞表达载体中， 可表达此基因抗性，可用新霉素筛选。 五 基因表达产物的检测 Western blotting 原理：当蛋白质被高分辨力的聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分离后，可被分离成许多不同的蛋白区带，由于蛋白的各个组分被固定于凝胶网状结构中。为了进一步检测它们的免疫活性，特将电泳后的蛋白带经电转移技术，转移到固相的硝酸纤维膜上，再和特异性的抗体结合，经直接或间接抗原-抗体反应法显示特异性的阳性蛋白条带。 Western blotting 步骤 蛋白电泳分离出大小不同的蛋白条