腺病毒介导p21抑制视网膜新生血管生成的实验研究-临床医学；眼科学专业论文.docxVIP

天津医科大学博士学位论文中文摘要目的：视网膜新生血管(retinalneovascularization，RNV)性疾病是目前主要的致盲眼病，而新生血管的生成依赖于血管内皮细胞的不断分裂增殖。p21是细胞周期中重要的负性调控因子，主要参与细胞周期中G1／S期调控点的调控，可使细胞阻滞于G1期，抑制细胞增殖。本研究通过建立氧诱导RNV小鼠模型并检测p21、CDK2及CyclinEmRNA和蛋白在视网膜组织中的表达，探讨p21在RNV生成过程中的作用及机制；进而应用腺病毒载体将p2l基因转染至猴视网膜微血管内皮细胞及RNV模型小鼠视网膜组织，观察其对血管内皮细胞增殖、迁移及RNV的抑制作用及机制。‘方法：(1)选取7日龄C57BL／6J小鼠，共96只，随机分为实验组与对照组，每组48只。实验组小鼠按照Smith法建立氧诱导RNV模型，分别于P12、P17、P22时行荧光视网膜铺片及组织病理学检查评估两组小鼠RNV的发生情况，行逆转录聚合酶链反应(reversetranscription．polymerasechain reaction，RT-PCR)及蛋白免疫印迹(Westernblot，WB)检测p21、CDK2及CyclinEmRNA和蛋白在两组小鼠视网膜组织中的表达。(2)体外培养猴微血管内皮细胞(IU／6A)，取第3～5代处于对数生长期的RF／6A接种到6孔板内，细胞同步化后，分为磷酸盐缓冲液(phosphatebufferedsolution，PBS)组、腺病毒介导p21基因(adenovirusmediateddeliveryofp21，Ad．p21)组及腺病毒介导空基因(adenovirusmediateddeliveryofnon．targetcontrol，Ad-NC)组，分别应用PBS、Ad-p21及Ad-NC转染RF／6A，培养48h，行流式细胞仪、Transwell检查及成管实验，行RT-PCR及WB检测p21、CDK2及CyclinEmRNA和蛋白在RF／6A中的表达。(3)选取7日龄C57BL／6J小鼠，共80只，随机分为对照组、PBS组、Ad．p21组及Ad-NC组，每组20只。其中PBS组、Ad-p21组及Ad-NC组小鼠按照Smith法建立氧诱导RNV模型。P1 1时，正常组不做任何处理，PBS组、Ad．p21组及Ad-NC组玻璃体腔分别注入PBS、Ad．p21及AdoNC lul。P17及P22时行荧光视网膜铺片及组织病理学检查评估RNV的发生情况，P17时行RT-PCR及WB检测p21、CDK2及CyclinEmRNA和蛋白在视网膜组织中的表达。结果：(1)与对照组比较，P1 7时实验组小鼠荧光视网膜铺片显示大面积无灌注区及荧光素渗漏，视网膜切片可见大量突破内界膜的血管内皮细胞核。实验组小鼠视网膜组织中p21 mRNA和蛋白表达较对照组明显下降，差异有统计学意天津医科大学博士学位论文义；而CDK2和CyclinEmRNA及蛋白表达较对照组则明显升高，差异有统计学意义。(2)流示细胞仪结果显示Ad-p21组RF／6A细胞出现G0／G1期阻滞，G0／G1期细胞较PBS组及Ad-NC组比例明显增多，差异有统计学意义。Transwell结果显示较PBS组和Ad-NC组，Ad．p21组RF／6A细胞穿膜能力明显减弱，穿膜细胞数较少，差异有统计学意义。体外成管实验显示较PBS组和Ad-NC组，Ad．p2l转染组内皮细胞管数较少，差异有统计学意义。Ad-p21组细胞中p21mRNA和蛋白表达较PBS组和Ad-NC组明显升高，差异有统计学意义；而CDK2和CyclinEmRNA及蛋白表达较PBS组和Ad-NC组则明显降低，差异有统计学意义。(3)Ad．p21组视网膜无灌注区及新生血管较PBS组和Ad-NC组明显减少。Ad．p21组视网膜组织p21 mRNA及蛋白表达较其余三组显著增高，差异有统计学意义，而CDK2和CyclinEmRNA及蛋白表达较其余三组显著降低，差异有统计学意义。结论：(1)p21表达降低可能是视网膜新生血管生成的发病机制之一。(2)Ad介导p21通过上调p21及下调CDK2、CyclinE的表达，发挥对细胞周期的调控作用，使RF／6A细胞停滞于G0／G1期并抑制其增生和迁移。(3)Ad介导p21可通过上调p21及下调CDK2、CyclinE的表达，抑制视网膜微血管内皮细胞的分裂、增生，从而发挥其抑制视网膜新生血管生成的作用。关键词：视网膜新生血管化／预防和控制p21基因转移技术转染动物实验ll天津医科大学博士学位论文AbstractObjective：Theretinalneovascularizationdiseases,whichresultfrompathologicalang