2011研--细胞融合介绍.pptVIP

实验七 细胞融合 要求：实验结束各组清洗物品及实验台 后方可离开。 作业： 1、细胞融合时主要受哪些因素的影响？ 2、进行细胞融合的操作时，重点注意的事项有哪些？ 3、计算两种细胞的融合率，并绘图表示所观察到的融合细胞。 * * * * 安排： （1）本次实验分大小组操作； （2）每实验台（6人）为大组； 单面三位同学为一小组； （3）二个操作试验中，每小组皆做，结果由组员共享。 ★聚乙二醇介导的细胞融合： （新P178，旧P127） 1. 鸡血红细胞的融合 2. 培养细胞的融合 1、鸡血红细胞的融合 ＊实验材料：成年公鸡 ＊实验器材：离心机，离心管，微量取样器，吸管，水浴锅，载玻片，盖玻片，显微镜 ＊ Alsever溶液、GKN溶液、0.85％生理盐水、50％PEG溶液，双蒸水 ＊实验操作步骤 （分大小组操作，大组做1-3，小组自4开始） （1）在公鸡翼下静脉抽取2ml鸡血，加入盛有8ml的Alsever液中，使血液与Alsever液的的比例达1∶4，混匀后可在冰箱中存放一周； （2）取此储存鸡血0.8ml加入4ml的0.85％生理盐水，充分混匀，800r/min离心5min，弃去上清，加入5ml的0.85％生理盐水,混匀，离心。共两次。最后弃去上清，加GKN液4ml，离心； （3）弃去上清，加入约3~5ml的GKN溶液（已经预热的），制成细胞悬液；（也可以用血球计数板计数，用GKN液将其调整为4×107个/ml）； （4）取以上细胞悬液1ml放入10ml的离心管中， 将0.5ml的50％PEG溶液（预热20min）逐滴沿离心管壁加入到细胞悬液中，边加边摇匀，然后放入37℃水浴中保温30~40min； （5）之后加入GKN溶液至8ml，静止于水浴中15min左右； （6）1000r/min离心5min； （7）弃去上清，加入GKN液少许，混匀，取少量悬液滴于载玻片上，晾干，甲醇固定，晾干后Giemsa染色5—10分钟，自来水冲洗，镜下观察细胞融合情况。 注意事项（1）水浴锅内液体使用时注意保持平衡； （2）实验台的物品及时归位； （3）用过的物品清洗干净，实验台整理。 融 合 过 程 融 合 过 程 鸡血细胞的融合 2、培养细胞的融合 ＊实验材料：人宫颈癌细胞系SiHa ＊实验操作步骤 （大组做1-3，每小组制片） （1）收集处于对数生长期的细胞，制成细胞悬液； （2）D-Hanks液离心洗涤一次，弃上清后制成0.1ml细胞悬液； （3）逐滴加入0.5ml预热的37℃的PEG溶液，边加边摇，90s内加完。随即缓慢加入一定量D-Hanks液以稀释终止PEG的作用，边加边轻摇离心管。静置于37℃ 水浴5min； （4） 离心弃上清后加D-Hanks液制成细胞悬液，取少量悬液滴于载玻片上，晾干，甲醇固定，晾干后Giemsa染色5—8分钟，自来水冲洗，镜下观察细胞融合情况。