细胞培养课堂教学.ppt

* * 细胞培养技术绪论 一．细胞培养（cell culture）的概念 广义：泛指所有体外培养，即：从动物活体体内 取出组织，于模拟体内生理环境的体外条 件下使之生存、生长。 依产生培养物的方法，可分为三种： 细胞培养：将从活体取得的组织用机械或消化的 方法分散成单个细胞后，进行培养； 组织培养：直接将从活体取得的组织剪成小块后, 进行培养； 器官培养：将活体器官的一部分取出，进行培养。 二．细胞培养技术的主要特点 （一）优点 1．研究对象是活细胞：能直接、长时间地观察细胞的形态、结构、生命活动及相应的变化； 2.为其它生物学技术、方法（免疫组化、原位杂交、分子杂交、同位素标记等）提供大量的、生物性状相似的实验对象。 3.研究条件可人为控制，可以较为准确、恒定地了解某一因素（物理、化学及生物）对细胞的影响。 （二）不足 体外分化：培养细胞与活体细胞在形态、功能均有差 异。 肝细胞：产生酪氨酸酶的特性丧失； 上皮细胞、神经细胞：产生、分泌胶原。 ? 三．培养细胞生存环境、条件 （一）无污染、无毒环境 原因：体外环境中缺乏免疫系统及解毒器官 涉及方面：培养过程所需的器械、溶液均需消毒； 培养液、PBS液等中加双抗； （二）温度、气体环境 1.最适温度：370C 超过370C，代谢加快，430C以上1小时，细胞将被杀死； 低于370C，代谢减慢，在25-350C时，细胞仍能生存、生长， 但速度较慢； 2.培养细胞所需的气体环境：95%空气+5%CO2 CO2的主要作用：即是代谢的产物，又是细胞所需的成分，是维持培养基PH值的重要因素. （三）营养物质 成分： 主要：糖、氨基酸、脂肪 其它：无机盐、维生素、微量元素、 激素（生长因子） 来源：培养基： 天然培养基：血清：小牛血清、胎牛血清， 含多种蛋白质、核酸，有促进细 胞生长及贴附的作用，还可中和 某些毒性物质的毒性作用。 血浆、胎汁 合成培养基：根据细胞所需物质的种类、数量严格配制 而成。 无血清培养基：在基本的合成培养基添加多种促细 胞因子（三碘甲状腺素、转铁蛋白、EGF等 四．细胞培养基本技术 （一）原代培养（primary culture）（初代培养） 定义：从供体获得组织后的首次培养。 优点：组织、细胞刚脱离机体，在生物学性状方面较接近体内状态； 不足：细胞成分较复杂（常包括多种类型的细胞） 适用范围：研究基因表达、药物效果的测试 方法： 组织块培养法：过程 消化培养法：过程 （二）传代培养（subculture） 定义：细胞由原培养瓶分离、稀释后传到新的培养瓶的过程，称为传代。 过程（贴壁细胞）： （三）细胞冻存 原理：体外培养的细胞，随着传代次数的增加，其各种生物特性会逐渐发生变化，为此，需将培养的细胞及时加以冻存。 方法：向培养基中加入冻存剂（10%二甲亚砜、甘油），使冰点下降，减少冰晶的形成； 缓慢冻存：-40C、-200C、-850C 时间：原代培养或传代早期。 （四）细胞复苏 定义：冻存了一段时间的细胞，被取出融解，重新接种恢复其活力的过程。 方法：冻存细胞于370C、水浴中快速融化，离心，弃上清液，再接种。 五．培养细胞的生长方式、形态 （一）贴附生长型：为大多数体外培养细胞的生长方式，指细胞贴附于底物（支持物）表面生长。 特点： “反祖现象”:失去体内原有的形态特征，形态趋于单一，并常反映其胚层的起源 两种类型： 上皮细胞型：扁平、多角型; 细胞之间紧密相连、互相衔接（类似于体内生长