医学细胞生物学课件：3 研究方法-2.pptxVIP

第三章 细胞生物学研究方法; 将细胞从实体或悬液组织中分离出来 第一步：将组织制备成游离的细胞悬液 ;;;;2.流式细胞术精确分选荧光标记的细胞;;样品处理：用带荧光的特异抗体标记带分离的细胞分离速度：20000个/s 分离纯度：95%;;3.免疫磁珠法获得高纯度细胞;4.激光捕捉显微切割技术（Laser Capture Microdissection,LCM）;;;;二、细胞培养;;1. 细胞培养的条件;2. 原代和传代培养;细胞系(cell line) ： 在培养细胞过程中产生“不死”的变异细胞，这种细胞可以无限繁殖、传代。 来源: 1）培养过程中发生转化的正常细胞 2）由癌细胞建立的“癌细胞系” 特点:可在培养皿中以极高的密度增殖，没有扩展 的余地时,可向空间生长。 3）正常细胞经诱导建立的“转化细胞系” 肿瘤病毒、放射线、化学致癌物、癌基因转染 ;细胞株(cell strain)：用细胞克隆化的方法进一步改善细胞系的均一性，即分离出单个细胞使之增殖形成细胞群。 克隆（clone）：指由同一个祖先细胞通过有丝分裂产生的遗传性状一致的细胞群。 ;细胞融合;促融方法;应用;单克隆抗体制备（monoclonal antibody）;;第三节 细胞组分的分离和纯化技术;一、细胞裂解;二、细胞器及细胞组分的分级分离;细胞匀浆;（二）速度沉降;;（三）平衡沉降;非细胞体系;三、蛋白质的分离与鉴定;常用的柱层析：;2）凝胶过滤层析 填充基质：多孔性凝胶颗粒 分离原理：大小不同;3）疏水性层析 填充基质：带有疏水性基团的颗粒 分离原理：疏水性不同 4）亲和层析 填充基质：结合有酶底物、特异性抗体或抗原的颗粒 分离原理：亲和性不同;（二）高压液相层析;三、用电泳的方法分析、鉴定蛋白质;1.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）;;;2.等电聚焦电泳;分离原理：依据等电点不同分离蛋白质（所有蛋白质在电泳时都向自己的等电点处移动，最后聚集、静止与各自的等电点。）;3.双向电泳;应用：单向SDS－PAGE电泳分辨力差，只能分开50种左右的蛋白。双向电泳可分辨1000种以上的蛋白质，一般为2000～15000种。 ;第四节 细胞内的分子示踪;一、放射自显影技术;操作过程;举例:分泌蛋白在细胞内合成、运输及分泌;二、活细???内分子示踪;;;第五节 细胞功能基因组学研究技术;(一）印迹杂交技术;;（二）原位杂交;（三）荧光实时定量PCR技术;3.PCR反应步骤： 1）变性(95℃)： DNA双链解离 2）退火(45-65℃)： DNA模板与引物互补结合 3）延伸(72℃)： DNA聚合酶作用下的互补链合成 ;荧光实时定量PCR;二、基因表达的上调和下调技术;1）直接微量注射法 2）电休克法 3）转染 4）感染 ;;（二）RNA干扰技术是下调基因表达的常用方法;三、蛋白质相互作用的研究技术;（一）免疫沉淀（immuno-precipitation，IP）;;（二）酵母双杂交;（三）噬菌体展示;第六节 生物大分子的结构测定;第六节 生物大分子的结构测定;; 特点：样品不需结晶，以溶液形式置于强磁场中测定 用途：测定大分子三维结构