医学细胞生物学课件：3 研究方法-1.pptVIP

1.扫描焦平面→提供高清晰的彩色二维图像 应用： 2.扫描一系列焦平面→提供高清晰的彩色三维图像 应用： 二、电子显微技术 电子显微镜的分辨率 Rx,y=0.61 λ /n?sinθ 用电子束作光源 波长短，大大提高分辨率 理论值：0.002 nm 实际值：0.1 nm 生物样品：2 nm 是光学显微镜的100倍 电子显微镜下观察到的细胞结构称为亚显微结构 高尔基体 核糖体 （一）透射电子显微镜用于观察细胞的超微结构 光学显微镜与透射电子显微镜的比较 电子枪 光源 聚光镜 样品 物镜 物镜 透射镜 眼睛直接观察 荧光屏或相片 透射电子显微镜 光学显微镜 透射电镜标本制备过程: 1)取材: 尽可能保持生活状态,避免损伤 必须耐真空 由于电子穿透力弱,标本必须超薄 标本反差应尽可能大(生物材料原子系数低,图像反差大,不易出现明暗差别) 取材、固定、脱水、包埋、切片、染色 2)固定: 为防止生物样品在死亡后和脱水过程中产生结构改变,离体生物标本迅速固定。 双重固定——四氧化锇固定脂肪 ——戊二醛共价键交联蛋白质 3）脱水: 标本必须置于高真空中进行电镜观察,所以电镜不能观察含水的生物标本。 4）包埋: 为使柔软生物组织制成超薄切片,并使切片耐受高真空、电子轰击,则在切片前将标本进行包埋。 常用环氧树脂。 5)切片: 电子穿透力很弱,需将样品制成50～100nm厚的薄片。 6)染色: 电镜下标本的反差取决于组成元素的原子序数 生物分子由原子序数低的轻元素组成，散射电子能力弱,在电镜下几乎不存在明暗反差,需通过重金属染色增大反差,常用锇、铀、铅。 锇——脂类——膜性结构 （二）扫描电子显微镜直接观察表面三维结构 原理： 通过电子束照射在标本后产生二次电子成像，二次电子产生的多少与电子束在标本表面的投射角有关。 应用：可以直接观察标本表面的三维形态。 扫描电镜照片展示 注射针头的扫描电镜照片 扫描电镜照片展示 不同倍率的果蝇扫描电镜照片 扫描电镜照片展示 可以用计算机将黑白照片处理成彩色 扫描电镜照片展示 肺细支气管粘膜杯状细胞和纤毛细胞扫描电镜照片 扫描电镜照片展示 红血球 扫描电镜照片展示 培养细胞 （三）透射电子显微镜可获取三维图像 1.金属投影法 以一定的倾斜角度向样品表面喷重金属，显示投影效果，给出样品表面三维结构。 应用：观察蛋白、核酸类大分子，病毒颗粒及细胞壁 2.冰冻断裂法 原理： 样品快速冷冻→冰刀从脂质双分子层疏水部分撬开→暴露膜内部构造→喷铂 应用： 观察细胞模型结构 的内部构造 3.冰冻蚀刻法 原理： 冷冻组织→冰刀撬组织→真空中升华→暴露膜结构→喷铂 应用：观察细胞的内部构造 三、纳米显微技术 “纳米水平”：1 nm-100 nm 生命是纳米尺度的分子活动，细胞是纳米组装机的集合体。 扫描隧道显微镜和原子力显微镜的分辨率和可操控的颗粒在纳米水平，被称作纳米显微技术。 1.扫描隧道显微镜 原理：使用原子尺度的探针，与样品保持1nm距离，，在探针针尖和样品间施加一定电压，产生随标本形貌变化的隧道电流。 特点： 分辨率高，可在大气和液体等非真空状态下工作 应用： 直接观察大分子的三维结构，如DNA双螺旋结构 2.原子力显微镜 原理：接触，通过分析探针针尖与样品之间的原子间作用力来获取所观察表面的微观信息。 特点：可以在三态（固态、气态和液态）状况下工作 应用：活细胞表面及生物大分子空间伸展及其结晶体表面观测，可以进行单个分子操作。 原子力显微镜观察到大肠杆菌30纳米长的鞭毛 * 第三章 细胞生物学研究方法 新技术 新领域 光学显微镜——发现细胞 电子显微镜——细胞器、亚微结构 高速离心机——分离细胞器 第一节 显微镜技术 人眼分辨率——100 μm 动物细胞——10-20 μm 核糖体、抗体、ATP——1-100 nm 光学显微镜 电子显微镜 纳米显微镜 同步诞生、发展 降低最小分辨间隔，呈现细胞内精细活动,实时呈现细胞内分子间作用过程 一、光学显微镜技术 （一）普通光学显微镜 1.衡量显微镜成像能力的指标 ——分辨率(Resolution, R) 显微镜或人眼在25cm的明视距离处，能够区分相近两点间的最小距离。 横向分辨率Rx,y=0.61λ/n ? sinθ 纵向分辨率Rz=2 λ(n ? sinθ)2 n = 聚光镜和物镜之间介质的折射率 （空气为1，镜油为1.3-1.5） θ = 标本对物镜张角的半角（ sinθ最大为1） λ = 照明光源的波长（白光527nm） n ? sinθ为镜口率，数