目的基因的获取 生物制药工艺学.pptVIP

1) 变性(Denature):目的双链DNA片段在94℃下解链; 2) 退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对; 3) 延伸(Extension): 70℃.DNA模板—引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程 * 目的基因的获取 小组成员：沈赏洁，叶丽冰，蔡万辉，余丙洁，陈娜子，陈凌峰,王宇，夏青海，陈美灵 什么是目的基因？ 准备分离、改造、扩增或表达的基因 目的基因获取方法 直接分离法 构建基因组文库分离法 PCR分离法 化学合成法 直接分离法 限制性核酸内切酶法 随机片断法 物理化学法 限制性核酸内切酶法 用限制性核酸内切酶把基因组DNA切成不同大小的片断。五步。 优点 绕过直接分离的难关。由于带有黏性末端，产物可以直接与载体连接。缺点 目的基因内部也可能有该酶的切点。目的基因也被切成碎片。需要简单的筛选方法。 随机片断法 分子杂交法？ 一、限制性内切酶局部消化法 控制内切酶的用量和消化时间，使基因组中的酶切位点只有一部分被随机切开。 选酶原则： ①内切酶识别位点的碱基数 （影响所切出的产物的长度和随机程度） ②内切酶黏性末端 （能与常用克隆位点相连） 二、机械切割法 1、超声波 超声波强烈作用于DNA，可使其断裂成约300bp的随机片断。 2、高速搅拌 1500r/min下搅拌30min，可产生约8kb的随机片断。 物理化学法 基本原理：不同基因片段的碱基组成差异较大，其物理性质，如浮力密度和解链温度等也明显不同 海胆近70%的基因都能与人类匹配 从这只紫色海胆的8.14亿个基因代码中，科研小组确认了23300个,其中有7077个基因在人类中也被发现。 韦士尔说：“人类与海胆竟然以如此不同的结构在器官中使用同样的蛋白。” 构建基因组文库分离法 概念： 基因文库（gene library） 将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小适合的片断，并将所有这些片断都与适当的载体连接，引入相应的寄主细胞中保存和扩增。 理论上讲，这些重组载体上带有了该生物的全部基因，成为基因文库。 基因文库构建的一般步骤 1、染色体DNA片段的制备 断点完全随机，片断长度合适于载体连接。 ①物理切割法： 超声波（300bp）或机械搅拌（8kb）。 ②酶切法： 内切酶Sau3A进行局部消化。可得到 10- 30kb的随机片断。 2、载体与基因组DNA大片段的连接 构建基因文库的载体选用 ①对载体的要求 载体能够容载的DNA片断大小直接影响到构建完整的基因文库所需要的重组子的数目。 ②目前常用的载体 载体与基因组DNA大片段的连接方式 直接连接、人工接头或同聚物加尾。 ①黏性末端直接连接 载体与外源DNA大片段的两个末端都有相同的黏 性末端。 ②人工接头 人工合成的限制性内切酶黏性末端片断 ③同聚物加尾 cDNA文库的构建 1、cDNA 以mRNA为模板逆转录出的DNA称cDNA。 2、cDNA library 利用某种生物的总mRNA合成cDNA，再将这些cDNA与载体连接，转入细菌细胞中进行保存和扩增，称cDNA文库。 3、cDNA文库的特点 ①不含内含子序列 ②可以在细菌中直接表达 ③包含了所有的编码蛋白质的基因 ④比DNA文库小的多，容易构建 4、构建cDNA文库的一般步骤 ①总RNA(total RNA)提取 提取总RNA有商业的试剂盒（kit）。 ②mRNA的分离纯化 利用mRNA都含有一段 polyA尾巴，将mRNA从总RNA （rRNA、tRNA等）中分离纯化 mRNA只占总RNA的1％-2％ ③cDNA的合成 （ Ⅰ ）cDNA第一链合成 你转录酶能以RNA为模板合成cDNA。 用Oligo dT（或随机引物）作引物，合成cDNA的第一链。 （ Ⅱ ）降解mRNA模板 用碱处理或用RNaseH降解mRNA-DNA杂交分子中的mRNA. ( Ⅲ )cDNA第二链合成 剩下的cDNA单链的3’末端一般形成一个弯回来的双链发卡结构（