实验四__PH对酶活力的影响.pptVIP

实验四 PH对酶活力的影响—最适的PH的测定 一．实验目的 1．了解PH对酶活力影响的机理； 2. 掌握测定最适PH的基本原理； 3. 掌握最适PH的测定方法。 二．原理 PH对酶活力的影响极为显著。酶表现其最高活性时所处的PH即酶的最适PH。通常各种酶只在一定PH范围内才表现它的活性。一种酶在不同PH下所表现出来的活性不同。 PH之所以对酶活性有很大影响，可能是因为它改变了酶活性部位有关基因的解离状态。 在最适PH时，酶分子上活性基团的解离状态最适于酶与底物的结合。而高于或低于最适PH时酶活性部位基团解离状态均不利于酶与底物的结合。酶活力也相应降低。PH也可影响底物的解离及反应系统中其他组分的解离。缓冲系统的离子性质和离子强度也可能对酶促反应产生影响。另外，PH对酶的活性有很大影响外，对酶的稳定性也有影响。过高或过低的PH会该表酶的活性中心构象，甚至改变整个酶分子的结构使其变性失活。 在保持其他反应条件恒定，而在一系列变化的PH下测定酶活力，以PH为横坐标，OD405为纵坐标作图，可得到一条PH-酶活力曲线，从中球的最适PH。 三．实训试剂与器材 1试剂 （1）酸性磷酸酯酶原酶液 （2）酸性磷酸酯酶酶液 将原酶液用水稀释10倍左右，使PH酶活力曲线中第六管OD405在0.6~0.7之间。 （3）2.4mmol/LNPP水溶液 精确称取NPP 0.8908g用水溶解并定容至1000mL。 （4）0.3mol/LNaOH （5）各PH缓冲液 ?0.05mol/L柠檬酸溶液 ?0.05mol/L柠檬酸三纳溶液。 2. 器材 恒温水浴槽，可见光分光光度计，试管，刻度吸管。 按表1-2配制，并测得数据为准 四．操作步骤与要领 1.酶促反应 (1). 取2支试管，各加入稀释好的酶液6mL,在35℃恒温水浴槽中保温2min (2). 取11支试管编号，0号为空白。各加入2.4mmol/L NPP 0.2mL, 相应加入不同PH缓冲液各1.8mL, 各管再加入预保温过的酶1mL，立即摇均计时，15min后加入0.3mol/LNaOH 2.0mL终止反应。 2．测定OD405值 0号管先加入0.3moL NaOH 2.0mL之后再加酶液，各管终极反应并冷却后侧OD405，将结果按不同PH对应记录。 3.数据处理 以反应PH为横坐标，OD405为纵坐标，绘制PH酶活力曲线，求出酸性磷酸酯的最适PH。 五．数据处理 绘出PH-酶活力曲线图，记录实验结果，计算酸性磷酸酯的最适PH。 * *