绿色荧光蛋白的克隆.doc

绿色荧光蛋白（GFP）基因的克隆与表达 摘 要 实验目的在于利用大肠杆菌的快速繁殖来克隆绿色荧光蛋白基因，从而来大量生产绿色荧光蛋白（green fluorescent protein），方法:通过对目的基因的提取，合适质粒的选取，构建基因工程所需的重组体，利用基因工程的方法，PCR技术，大量克隆目的基因，最后利用合适的技术又到基因表达，对产物检测后，确定目的基因是否达到克隆目的。 关键词 绿色荧光蛋白 大肠杆菌 基因工程 PCR技术 1 前言 绿色萤光蛋白(green fluorescent protein)，简称GFP，是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光。这种蛋白质最早是由下村修等人在1962年在一种学名Aequorea victoria的水母中发现。后来，美籍华人钱永健系统地研究了绿色荧光蛋白的工作原理，并对它进行了大刀阔斧的化学改造，不但大大增强了它的发光效率，还发展出了红色、蓝色、黄色荧光蛋白，使得荧光蛋白真正成为了一个琳琅满目的工具箱，供生物学家们选用。目前生物实验室普遍使用的荧光蛋白，大部分是钱永健改造的变种。3.2 酶切及连接 II型限制性内切酶中最普遍的是象EcoR I、Hind III、BamHI和Not I这样在识别序列中进行切割的酶。这一类酶是构成商业化酶的主要部分。大部分这类酶都以同二聚体的形式结合到DNA上，因而识别的是对称序列；但有极少的酶作为单聚体结合到DNA上，识别非对称序列。一些酶识别连续的序列（如EcoR I识别GAATTC；Hind III识别AAGCTT;BamHI识别G↓GATCC; Not I识别GC↓GGCCGC）；而另一些识别不连续的序列（如Bgl I识别GCCNNNNNGGC）。限制性内切酶酶切DNA后形成两种类型的末端：(i)两条链断裂的位置是交错地，产生粘性末端，如EcoR I酶切后产生末端；(ii)两条链的断裂位置处在一个对称结构的中心，产生平末端。 DNA连接酶能够催化在两条DNA链之间形成磷酸二酯键，这种酶需要在一条DNA链的3’-末端具有一个游离的羟基（-OH），和在另一条DNA链的5’-末端具有一个磷酸基团（-P）。 3.3 细菌感受态细胞的制备及转化 大肠杆菌转化试验的技术关键就是制备感受态细胞，即应用一些特殊的方法（如电击法，CaCl2、RbCl（KCl）化学试剂法）处理后，使细菌细胞膜通透性发生暂时性的改变，处于能允许外源DNA分子进入的状态，即为感受态细胞。 CaCl2转化法的基本原理是细菌在低温、低渗（0℃，0.1mol/L CaCl2)的溶液中，菌体细胞膨胀成球形，局部失去细胞壁或细胞壁溶解，外来的DNA可形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物黏附于细胞表面，经42℃短暂热冲击处理，促进DNA复合物进入细胞，从而实现外源基因的转化。 3.4 重组体的筛选和鉴定 由于实验中基因的转移方法的效率不高，真正摄入的重组DNA的受体不多，因此需要从中筛选出含有重组DNA 的细胞，并鉴定其正确性和基因表达的情况。 重组质粒DNA是利用限制性内切酶（如BamH I和Not I）分别酶切基因片段和质粒后，利用基因片段和质粒DNA一端带有相同的粘性末端连接起来的重组质粒，如果再利用相同的限制性内切酶识别重组基因片段两侧的酶切位点，通过酶切下的重组片段的大小与连接的基因片段大小是否相同判断质粒DNA是否为重组质粒。 3.5 GFP基因的诱导表达 IPTG（异丙基硫代β-L半乳糖苷）是一种常见的诱导基因表达的诱导剂，结构类似乳糖。GFP基因连接到pET-28a的多克隆位点（MCS），GFP基因的表达受其上游T7启动子和操纵基因O位点以及结合到这些顺式作用元件的蛋白因子的控制。LacI基因编码调节蛋白，可以四聚体的形式结合到操纵基因O位点上，关闭GFP基因的表达。IPTG可与四聚体调节蛋白结合，从而改变调节蛋白的构象，使调节蛋白不再与O位点结合。接着BL21编码的T7 RNA聚合酶结合到T7启动子位点，从而启动GFP基因的表达。 实验设备 恒温培养箱，超净台，恒温摇床，台式高速离心机，小型混合器，超低温冰箱，1.5ml EP管，高压灭菌锅，振荡培养箱，紫外分光光度计，UVette比色皿，水浴锅，电泳槽，电泳仪，振荡器，蓝盾可见光透射仪，凝胶成像仪，PCR仪，1.5ml离心管，移液器及吸头，手持式紫外灯,锋利刀片 实验材料及配制 5.1 试剂 灭菌的去离子水，PMD18-T(运载体）,pEGFP-N1（目的基因），EcoR I, Hind Ⅲ，DH5α（克隆菌），buffer K，BL21， Xho I(10U/μL) (TaKaRa公司)，T4D